不同亚型Numb蛋白对肝纤维化相关信号通路的影响

许燕楠，刘 平，慕永平

上海中医药大学附属曙光医院 肝病二科，上海中医药大学 肝病研究所，上海 201203

肝纤维化的发生是一个十分复杂的病理过程，从组织病理学角度来说，肝纤维化是慢性肝损伤条件下的创伤愈合反应，由于瘢痕组织形成改变了正常的肝脏结构和血液供应，导致肝功能障碍[1]。从细胞角度来说，慢性肝损伤导致肝实质细胞的死亡(坏死、凋亡)、Kupffer细胞活化等导致肝星状细胞(HSC)活化，并向肌成纤维细胞分化，导致组织中实质细胞被纤维细胞替代[2]。从分子角度来说，肝纤维化形成过程中涉及多种细胞因子，包括促炎因子、促纤维化因子等以及细胞内信号通路的改变。基因层面包括组蛋白乙酰化修饰，DNA甲基化在内的表观遗传也与肝纤维化密切相关[3]。目前，从分子水平探索肝纤维化的发病机制，并基此开展靶向药物的研发显得越发重要。Numb是一个进化保守的基因，具有控制细胞不对称分裂和细胞命运选择、胞吞作用、细胞黏附、细胞迁移、特定底物泛素化及多种信号通路等复杂的功能[4-5]。尽管哺乳动物中Numb基因的表达模式强烈提示其在神经系统的发育中发挥关键作用，但该基因也在大多数成体和胚胎组织中表达，表明其作用并不局限于神经发育[4]，目前研究较多的是其在肿瘤领域的治疗机制。也有研究[6]发现Numb在纤维化发生中也发挥重要作用，比如在肾纤维化中，Numb失去其特有的膜定位无法抑制Notch信号通路，导致肾小管细胞的死亡，加重纤维化进程。但尚不明确，Numb基因经选择性剪切后翻译的Numb蛋白不同亚型在纤维化疾病中扮演怎样的角色。本文综述了Numb蛋白各亚型的功能特点以及其在肝纤维化中的潜在应用前景。

1 Numb及其不同亚型的产生

Numb最早在果蝇感觉器官前体细胞中被发现[7]，其具有不对称分布和调控不对称分裂的特性，从而决定子代细胞命运，是重要的细胞命运决定因子。哺乳动物中的Numb表现出更为复杂的功能模式，主要与其在脊索动物谱系的共同祖先中获得外显子3(Exon3)有关，Exon3编码位于Numb蛋白N端的11个氨基酸，从而产生2个不同的结构域：含有Exon3或不含Exon3的磷酸酪氨酸(phosphotyrosine binding，PTB)结构域，自Exon3出现以来，人们逐渐发现Numb蛋白的PTB结构域具有结合多种蛋白质的功能，也参与部分细胞膜定位与调控胞吞和信号通路的作用[8]。另一个重要的功能域是富含脯氨酸区域(proline rich region，PRR)，其中包含外显子9(Exon 9)编码的48个氨基酸，不仅参与细胞内信号转导[9]，也与细胞增殖和分化密切相关[10]。Numb 4种主要亚型的产生就在于对Exon3和 Exon9的选择性剪切，根据PTB和PRR结构域是否包含11个氨基酸片段和48个氨基酸片段，将Numb蛋白分为4个亚型：Numb1 (Nbp72)，拥有完整的PTB和PRR结构域(PTBL, PRRL)；Numb2 (Nbp66)，缺失PRR结构域(PRRS)；Numb3 (Nbp71)，缺失PTB结构域(PTBS)；Numb4 (Nbp65)，既缺失PTBS又缺失PRRS[11]。这些亚型在调节信号通路与细胞功能方面发挥着截然不同的作用，可能为疾病治疗提供不同的分子靶点。

2 不同亚型Numb蛋白与肝纤维化的关系

目前Numb在肝纤维化中的研究尚少，其剪接变异的存在及其确切调控的生理相关性更是鲜为人知。有研究[12]认为，Numb可以促进纤维化肝脏的肝细胞再生，也有研究[13]发现微小RNA148a可显著上调Numb的表达，减轻肝癌小鼠的肝纤维化程度，但其在抗肝纤维化效应中的具体机制尚不明确。在分子水平上，Numb参与调控Notch、Hedgehog和p53依赖的信号通路[14]，鉴于这几条信号通路与肝纤维化的发生与发展关系密切[15]，以及Numb调控成体干细胞不对称分裂的特性[16]，提示Numb有可能参与肝纤维化的病理进程。由于不同亚型的Numb蛋白具有不同的功能，因此，其在调节信号通路与细胞增殖分化上也有所区别。故Numb亚型-信号通路-肝纤维化这三者之间的关系值得进一步的研究和探讨。

2.1 Numb亚型与Notch信号通路 Notch通路是一种保守的信号转导级联反应，近年来，Notch信号通路在肝纤维化发生中的作用及其机制受到广泛关注。首先，HSC自身、肝实质细胞或其他非实质细胞的Notch信号活化都会激活HSC[17-18]，使其转化为肌成纤维细胞，促进肝纤维化进展。其次，Notch信号通路激活可促进肝干细胞向胆管上皮细胞分化，促进胆汁淤积性肝纤维化的进展[19]。抑制Notch信号通路活化可抑制HSC活化以及肝纤维化进展[20]。提示探寻抑制Notch信号通路活化的手段可能有助于肝纤维化的防治。

Numb作为Notch信号通路的重要负向调控因子，在细胞分裂过程中，遗传Numb的细胞缺乏Notch活性，从而决定子代细胞命运[21]，但Numb抑制Notch的确切机制尚不明确，可能通过内吞作用[22]、泛素化途径、靶向Notch胞内结构域[23]或转录因子RBPJ-κ等[24]，且发现Numb亚型的切换可影响这一过程。有研究[25-26]发现，含有Exon9的Numb亚型表达增加却促进了Notch信号活化，如在肺癌研究中，发现Numb2(PTBL/PRRS)表达增加可有效抑制Notch信号通路活化，但当与拥有Exon9编码的PRR结构域的Numb1(PTBL/PRRL)拮抗后增加了Notch靶基因的表达[27]。除了Exon9，Exon3编码的PTB结构域的存在与否与Notch活性密切相关。在PC12细胞中，与拥有PTB结构域的Numb亚型(Numb1和Numb2)相比，缺乏PTB结构域(Numb3和Numb4)表现出更高的Notch活性[28]，这可能与泛素化途径相关。

近年来，大量研究[29]表明，Numb和Notch之间的生物拮抗作用主要依赖于泛素化。一方面，E3泛素连接酶LNX可靶向Numb引起Numb自身的泛素化和降解，从而降低了对Notch的抑制作用[30]。研究[31]表明，虽然Numb的4种亚型均能与E3泛素连接酶LNX结合，但只有Numb1(PTBL/PRRL)和Numb2(PTBL/PRRS)被泛素化及降解，其关键机制在于LNX的PDZ1结构域与PTB之间的相互作用。另一方面，E3泛素连接酶ITCH可引起Notch的泛素化，有研究[32]发现，删除PTB结构域C端的88个氨基酸后，其泛素化Notch的能力大大下降，表明Notch信号通路的泛素化需要一个完整的PTB结构域与泛素连接酶结合。上述结果表明，含有PTB结构域的Numb亚型可抑制Notch信号的活性，而PRR结构域可能会破坏这种抑制机制。因此，基于Numb蛋白不同亚型与Notch信号通路的关系及Notch信号在肝纤维化发生发展过程中所起的作用，研究Numb蛋白亚型在肝纤维化中的作用是十分有意义的，这可能为靶向分子治疗肝纤维化提供一个新方向。

2.2 Numb亚型与P53通路 P53作为一种典型的抑癌基因，可通过凋亡、细胞周期调控、细胞衰老等多种途径发挥抗肿瘤作用[33]，目前也发现其对代谢相关脂肪性肝病[34]和肝纤维化[35]具有调控作用。其中在肝纤维化环境中可以调控HSC的活化与衰老[36]，可能与诱导细胞铁死亡相关[37]。其缺失可使HSC的凋亡减少而导致广泛的肝纤维化[36,38]；其上调可促进HSC衰老而降低纤维化程度[39]。而P53的稳定离不开Numb的支持[8]。

P53被E3泛素连接酶MDM2结合并泛素化，从而调控其蛋白酶体降解，而Numb可以通过Exon3编码的11个氨基酸短链与MDM2的酸性域结合并抑制MDM2，从而稳定P53通路[8]。有研究[40]发现，敲除所有Numb亚型或只敲除Numb1/2可显著降低P53的表达水平，而沉默Numb 3/4则没有显著影响，认为只有含有完整PTB结构域的Numb亚型才能阻止P53的泛素化和降解。因此，基于Numb1/2对P53的稳定作用，P53对HSC的促凋亡效应，各亚型Numb蛋白在肝纤维化的意义值得进一步探究。

2.3 Numb亚型与Hedgehog信号通路 Hedgehog途径是一种复杂的、受严格调控的信号转导途径，可简化为4个主要组件：Hedgehog配体、受体，信号转换器和转录效应因子Gli[41]，在纤维化模型中，抑制Hedgehog信号通路可抑制HSC活化减轻肝纤维化[42]，而促进其表达则激活HSC[43]，并促进肝祖细胞向肌成纤维细胞分化进而加重肝纤维化的进展[44]。而该通路的抑制机制也有赖于Numb蛋白。

小干扰RNA (siRNA)介导的Numb敲除减少了内源性Gli1的泛素化[45]，其机制与Notch信号通路的泛素化途径类似，Numb可通过结合E3泛素连接酶ITCH靶向Gli1，促进其泛素化，从而减少Hedgehog的表达[46]。如前所述，Numb与ITCH结合需要一个完整的PTB结构域，故带有PTB结构域的Numb1与Numb2在抑制Hedgehog信号通路上可能具有更大贡献。

3 Numb亚型对纤维化肝脏肝干细胞分化与增殖的潜在影响

干细胞是一类具有自我更新和向特定谱系分化潜能的细胞群，细胞对称分裂和非对称分裂是其特有的性征和再生的机制[47]。成体肝脏中存在可分化为肝细胞或胆管上皮细胞谱系的双潜能干细胞，又称之为内源性肝干细胞，在纤维化过程中其也可以分化为肌成纤维细胞[48]。故调控肝脏干细胞的增殖与分化可能为肝纤维化的治疗提供更为理想的方案。

Numb具有不对称分布和调控不对称分裂的特性，从而调节胚胎和成年器官中干细胞及祖细胞的增殖、分化，决定干细胞命运和自我更新。与果蝇神经干细胞分化相似，早期有研究[49]发现，在小鼠神经系统发育过程中，也因为Numb的不对称分裂，拥有Numb的子细胞可以抑制该子细胞的Notch活性从而诱导神经元分化。而在肝纤维化中，抑制Notch信号通路可以抑制肝干细胞向胆管细胞分化从而减轻纤维化程度[20]，且不同的亚型具有不同的功效。在癌症研究中，PRRL促进癌干细胞的增殖而非分化，PRRS则促进其分化而非增殖[10]。如在肝细胞癌中，PRRL型Numb的表达高于PRRS型，促进了肝癌干细胞的增殖，导致预后不良[50]。目前尚未有Numb对肝干细胞不对称分裂调节的直接证据，但可能具有潜在效应。

4 小结

综上所述，Numb是一个重要的细胞命运决定子，因基因选择性剪切Exon3或Exon9而主要产生4种亚型蛋白。尽管各亚型Numb蛋白与肝纤维化之间的关系尚未明确，但基于拥有的PTB结构域的Numb1或Numb2可能通过与不同E3泛素连接酶结合促进Notch、Hedgehog信号通路的泛素化，稳定P53信号通路，以及调控肝干细胞的分化取向等研究证据，提出合理展望：Numb1或Numb2可能可以抑制肝纤维化进展，但尚不清楚Numb3和Numb4是否会加重肝纤维化或不产生效果，因此围绕Numb亚型探寻肝纤维化的潜在分子靶点是一个值得深入的新课题。简言之，调控Numb选择性剪切，或提高Exon3的表达，可能成为肝纤维化治疗的潜在手段。

作者贡献说明：许燕楠负责收集查阅文献并撰写论文；刘平负责修改论文；慕永平负责指导撰写文章并最后定稿。