“养元通络”针法对2型糖尿病大鼠肝脏IRS-1/PI3K/AKT/GSK-3β通路的影响❋

徐 俊， 张 瑶， 胡昭端， 张誉丹,3， 周晓红， 谢有琼， 彭 锐△

(1.湖北中医药大学， 武汉 430065；2.武汉市中西医结合医院， 武汉 430022；3.风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是以机体出现高血糖变化为特征的全身慢性代谢性疾病，根据国际糖尿病联盟(international diabetes federation, IDF)官方统计，2017年全球20～79岁糖尿病患者总数为4.25亿，而中国的糖尿病总人数1.14亿，列全球首位，其中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)占总数90%以上[1]。T2DM患者血糖异常可诱发视网膜病变、心血管疾病、肾病和外周神经系统病变等多种疾病[2]，甚至导致伤残。据IDF统计，2017年全球有超过2/3的T2DM患者出现糖尿病并发症，约有400万人因糖尿病及并发症死亡[3]。糖尿病的高发病率给个人和国家带来了沉重的医疗负担，血糖控制和相关并发症的诊治消耗了大量的医疗资源[4]。胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)是T2DM发病的核心机制之一，胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate, IRS-1)/磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)/糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)信号通路上调，可促进肝组织糖原合成，抑制糖原分解，降低血糖，从而改善胰岛素抵抗[5-7]。T2DM属于中医学“消渴”范畴，病位在肾，与肝、脾、胃等相关[8]。针灸作为传统中医外治方法，具有简便效验的特点。湖北中医药大学针灸骨伤学院彭锐教授从事中医临床工作30余年，认为T2DM中医病机当属元气亏虚、络脉不通，提出养元通络法指导针刺治疗T2DM，并以双侧脾俞、肾俞、足三里、三阴交配伍取穴。在前期临床实践中，发现养元通络针法可以调控2型糖尿病患者血糖，但具体机制尚不明确。本研究旨在观察“养元通络”针法对T2DM模型大鼠IRS-1、PI3K、AKT、GSK-3β及相关指标腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)的影响，探究其疗效的可能机制。本研究经湖北中医药大学动物伦理委员会批准，批准号HB1245D。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级3月龄雄性SD大鼠50只，体质量(200±20)g，购于湖北省医学科学研究院实验动物中心，实验动物许可证号SCXK(鄂)2015-0018。饲养于湖北中医药大学SPF级动物实验室，饲养条件每笼5只，温度(23±2) ℃，相对湿度40%～60%，光照时间每日12 h，大鼠可自由取食饮水。

1.2 主要试剂与仪器

S-0130链脲佐菌素(美国Sigma公司)；盐酸二甲双胍片(中美上海施贵宝药制有限公司，国药准字H20023370)；磷酸脂酶抑制剂(碧云天，S1873)；PMSF(碧云天，ST506)；RIPA P0013B裂解液(碧云天)；P0010S BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)；TEMED Amresco0761(上海玉博生物科技有限Amresco公司)；兔多抗pi3k(Bioss公司，Bs-20611r)；兔多抗AKT(Affinity公司，Af6261)；HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德，BA1054)；ECL底物液(Thermo公司，NCI5079)。

血糖检测仪(江苏鱼跃医疗公司，yuwell580)；实时荧光定量PCR仪(ABI公司，QuantStudio 6)。引物由北京擎科生物科技有限公司设计合成。

1.3 动物模型制备

将大鼠适应性喂养1周，参考文献采用链脲佐菌素腹腔注射进行造模。大鼠禁食12 h，链脲佐菌素临用前用0.1 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.2，4 ℃)溶解，按25 mg/kg的剂量腹腔注射，每日1次，连续注射2 d[9]。继续喂养1周后，血糖检测仪检测空腹血糖(fasting blood-glucose, FBG)高于7.8 mmol/L提示模型成功。

1.4 分组与干预方法

按照随机数字表法将所有大鼠分为正常组、模型组、针刺组、二甲双胍组、假针刺组5组各10只。正常组与模型组不做任何干预，针刺组参照李忠仁[10]《实验针灸学》，选穴双侧“后三里”“脾俞”“肾俞”“三阴交”，假针刺组选穴在标准穴位旁开5 mm处，针具选择0.20×25 mm中研太和牌针灸针，针刺深度5 mm，针柄连接华佗电子针灸仪，选用连续波频率2Hz，强度1 mA进行干预。单次干预20 min，造模后即开始干预，每日1次，每周休息1 d，连续干预4周。二甲双胍组每日按125 mg/kg剂量对大鼠进行灌胃治疗，治疗时间与针刺组相同。

1.5 血糖检测和标本采集

随机血糖(random blood-glucose, RBG)测定于大鼠干预4周后的早晨7～9时。次日禁食24 h、禁水2 h，尾静脉采血，血糖检测仪检测FBG水平后，颈椎脱臼法处死全部大鼠，打开腹腔采集肝左叶同一区域的肝组织样本，装入无菌EP管中，-80 ℃保存备检。

1.6 免疫印迹法检测肝组织PI3K、AKT

肝组织样本1 g剪碎，用含PMSF的裂解液进行裂解，离心后提取蛋白，定量、变性、配胶、上样、电泳、转膜、封膜，一抗(GAPDH为1∶1000，PI3K、AKT为1∶500)4 ℃孵育过夜，二抗孵育、显影得出条带，采用Image J软件进行定量分析。

1.7 实时荧光定量PCR检测肝组织IRS-1、GSK-3β、AMPK mRNA

肝组织样本100 mg用液氮充分研磨，加入1 mL Trizol混匀，室温放置5 min充分裂解，加200 μl氯仿混匀使水相和有机相充分接触，离心后吸取上清加等体积异丙醇，混匀室温静置10 min，-20 ℃过夜，离心后去上清收集RNA沉淀，75°乙醇溶液洗涤2次，超净工作台风干沉淀，根据沉淀量加入DEPC水溶解RNA。然后进行RNA反转录，采用2-ΔΔCt法计算结果(见表1)。

表1 引物序列表

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 干预后各组大鼠 FBG与RBG比较

图1示，与正常组比较，模型组大鼠FBG与RBG明显增高(P<0.01)；与模型组比较，针刺组、二甲双胍组FBG与RBG明显降低(P<0.05)；假针刺组FBG、RBG与模型组比较差异无统计学意义。

注：与正常组比较：**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05

2.2 干预后各组大鼠肝组织PI3K、AKT蛋白水平比较

图2示，与正常组比较，模型组大鼠肝组织PI3K、AKT蛋白表达明显降低(P<0.01)；与模型组比较，针刺组与二甲双胍组PI3K、AKT蛋白表达升高(P<0.05)；假针刺组PI3K、AKT表达与模型组比较差异无统计学意义

注：与正常组比较:**P<0.01；与模型组比较:#P<0.05；磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)

2.3 干预后各组大鼠肝组织IRS-1、GSK-3β、AMPK mRNA比较

图3示，与正常组比较，模型组大鼠肝组织IRS-1 mRNA、AMPK mRNA表达明显降低(P<0.01)，GSK-3β mRNA表达明显升高(P<0.01)；与模型组比较，针刺组与二甲双胍组IRS-1 mRNA、AMPK mRNA表达升高(P<0.05)，GSK-3β mRNA表达明显下降(P<0.05)；假针刺组IRS-1、GSK-3β、AMPK mRNA表达与模型组比较差异无统计学意义。

注：与正常组比较：**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05；胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate, IRS-1)、糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)

3 讨论

T2DM属于中医学“消渴”范畴，病属本虚标实，虚实夹杂。彭锐认为其病机特点为元气亏虚，络脉瘀滞。元气为一生之本，元气耗伤脏腑机能下降，气血痰瘀可化滞为标，阻滞经络。同时，邪气耗伤正气，迁延日久则气血阴阳皆可致虚，导致络脉空虚，即所谓“久病入络”“久病多虚”，因此临床T2DM治疗当以养元为主、通络为要，并提出养元通络法指导针灸进行治疗。脾俞、肾俞分别为脾肾之背俞穴，肾为先天之本，脾为后天之本，二者为一身元气之根蒂，先后天之真元，对人体生命活动和疾病转归意义重大。《扁鹊心书·扁鹊灸法》：“盖脾为五脏之母，后天之本，属土，生长万物者也。若脾气在，虽病甚不至死……盖肾为一身之根蒂，先天之真源，本牢则不死。[11]”足三里为足阳明经合穴，胃之下合穴，五行属土，故能养元气。如《通玄指要赋》：“三里却五劳之羸瘦”[12]，也可以通经络，如《马丹阳天星十二穴治杂病歌》：“能通心腹胀，善治胃中寒，肠鸣并泄泻，腿肿膝胻酸。[12]”三阴交为八总穴之一，脾肝肾三经气血交会之所，针灸此穴可通三阴经络，调全身气机。本研究中，选择双侧“脾俞”“肾俞”“足三里”“三阴交”进行针刺干预T2DM模型，共奏养元通络之功。

IR是T2DM发病的主要环节，贯穿于疾病发生发展的全过程，临床IR患者约占T2DM患者总数的90%，绝大多数IR的发生与胰岛素和胰岛素受体结合后的信号传导障碍相关，从而导致胰岛素受体酪氨酸激酶活性下降、下游胰岛素信号异常传导、糖原合成酶活性减弱、葡萄糖转运减少等[13，14]。肝脏是胰岛素作用的靶组织，也是胰岛素耐受产生的主要部位[15]。在分子水平上，胰岛素由胰岛β细胞分泌入血，通过门静脉进入肝脏，与肝脏细胞膜表面胰岛素受体α亚基结合，引起胰岛素β亚基受体构型迅速发生改变，激活其酪氨酸激酶活性，使β亚基膜内的酪氨酸残基发生磷酸化[16，17]。活化的酪氨酸激酶可以将磷酸基团转移到同一受体其他β亚单位的酪氨酸残基上，也可以转移到细胞质中的一些可溶性蛋白底物的酪氨酸残基上，如IRS-1、磷酸化的IRS-1可以充当多种不同含SH2结构域蛋白质的结合位点[18，19]，进一步与下游的PI3K结合，导致AKT产生磷酸化效应，引起PI3K/AKT通路活化[20，21]。PI3K是细胞内重要的信号传导分子，参与调节细胞的增殖、凋亡和分化等生理过程。在胰岛素受体信号通路中，PI3K能被活化的IRS-1激活，促进三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol trisphosphate, PIP3)生成并激活AKT。AKT属于AGC蛋白激酶家族，是胰岛素受体信号传导途径中的关键蛋白激酶，在细胞生长与凋亡、糖类代谢过程中起重要作用。活化后的AKT抑制了GSK-3β的磷酸化作用，引起GSK-3β下游底物糖原合成酶(glycogen synthase, GS)活性升高[22，23]，从而促进肝脏糖原合成，抑制糖原分解，提高肝脏对葡萄糖的代谢，降低血糖，改善肝脏IR状况。AMPK是体内糖原调节中非常重要的蛋白激酶，同时也是机体内重要的能量转换器，其对三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)低水平做出反应，激活后对补充细胞 ATP 供应信号传导通路做出正向调控。研究表明，AMPK可以和IRS-1在Ser789 位点磷酸化，改善胰岛素敏感性，激活的AMPK也可以使IRS-1活性增加[24]。同时，活化的AMPK可以进一步激活其下游的Src蛋白和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)，促进葡萄糖转运体4(Glucose Transporters 4, GLUT-4)的转位和表达，增加机体葡萄糖摄取[25]。本次研究中，模型组大鼠空腹血糖和随机血糖明显高于正常组，而针刺干预后大鼠空腹血糖与随机血糖均有不同程度下降，初步证实养元通络针法的降血糖作用。同时，免疫印迹法和实时荧光定量PCR结果显示，模型组大鼠肝组织IRS-1、PI3K、AKT、AMPK表达明显下调，GSK-3β表达水平上调，而针刺干预后的大鼠肝组织IRS-1、PI3K、AKT、AMPK表达明显上调，GSK-3β表达下调，从而促进葡萄糖转运，提高糖原合成酶活性，提示养元通络针刺可以促进肝脏糖原合成，抑制糖原分解而改善IR。

综上所述，养元通络针法能上调T2DM大鼠肝脏PI3K、AKT、IRS-1、AMPK表达，下调肝脏GSK-3β表达，调控肝脏胰岛素抵抗，降低血糖，防治2型糖尿病。