基于网络药理学和分子对接技术研究柴胡桂枝汤治疗抑郁症的作用机制

蓝绍航 罗 俊,2 李娜娜 罗业浩 陈秋霞 陈静芹 李宏一 方 刚,3

1.广西中医药大学广西壮医应用基础研究重点实验室，广西南宁 530001；2.广西中医药大学现代教育技术与信息中心，广西南宁 530200；3.广西中医药大学附属瑞康医院国医堂，广西南宁 530011

抑郁症是一种常见的精神障碍性疾病[1]，世界卫生组织报告指出，2030 年后抑郁症将成为人们最大的健康挑战[2]。抑郁症属于中医“郁证”等范畴，其病位在肝，以肝气郁结为关键病机，治疗上以疏肝理气为原则，遣方用药多以柴胡类方剂疏肝解郁为主[3-4]。柴胡桂枝汤始载于张仲景《伤寒杂病论》，原方主治太阳少阳合病，现代临床可应用于治疗外感、神经系统等多种疾病。现代药理学研究发现[5]，柴胡桂枝汤可能是通过增加5-羟色胺的含量而达到抗抑郁的目的。多项研究表明[6-10]，临床中运用柴胡桂枝汤治疗抑郁症效果明显。目前临床上运用柴胡桂枝汤治疗抑郁症的研究较多，但仍缺乏对其相关作用机制的全面研究。网络药理学是药物研究的新模式，为中药发展提供了新的研究思想[11]。因此，本研究利用网络药理学结合分子对接技术的思路，深入阐述柴胡桂枝汤多成分、多靶点、多通路协同治疗抑郁症的作用机制，为后续临床实验研究提供相应的理论基础和参考。

1 资料与方法

1.1 药物有效成分筛选及靶点预测

在中药系统药理学数据库和分析平台筛选柴胡桂枝汤（柴胡、桂枝、白芍、黄芩、人参、半夏、生姜、大枣、甘草）的全部化学成分，并以口服生物利用度≥30%、类药性指数≥0.18 为筛选条件，确定药物的活性成分。在“Related Targets”一栏中找出其所对应的作用靶点，将所有药物靶点进行合并整理，剔除重复靶点；利用Perl 语言结合Uniport 数据库对靶点名称进行规范化。

1.2 疾病靶点获取

以抑郁症英文名“Depression”为检索词，限制检索条件为“gene”“homo sapiens”，在GeneCards、在线人类孟德尔遗传、药物基因组学知识库、TTD、DrugBank这5 个数据库中获取抑郁症相关靶点基因，将检索结果合并，删除重复靶点。

1.3 柴胡桂枝汤与抑郁症交集靶点筛选

将上述获得的药物靶点交集与疾病靶点基因交集通过R 语言绘制维恩图，对柴胡桂枝汤活性成分靶点与抑郁症相关靶点基因进行映射，得到药物与疾病交集靶点。

1.4 构建活性成分-疾病靶点网络

利用Cytoscape3.7.2 软件将以上所得的柴胡桂枝汤所有药物的活性成分交集和抑郁症靶点构建活性成分-疾病靶点相互作用网络图并对其进行分析。

1.5 构建蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction，PPI）网络及核心基因预测

将筛选得到的药物与疾病交集靶点导入STRING数据库，进行PPI 分析，得到PPI 网络图。将获得数据导入Cytoscape3.7.2 软件，使用CytoNCA 插件进行网络拓扑分析筛选关键基因。

1.6 GO 功能富集分析与KEGG 通路富集分析

将筛选得到药物与疾病交集靶点通过R 语言进行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析（两者均以P ＜0.05 为筛选指标）。

1.7 分子对接

为验证本研究数据及结果的准确性和可靠性，选取“1.4”和“1.5”项中度值（degree）排名靠前的活性成分与核心靶点，分别在Pubchem 数据库、蛋白质结构数据库中下载活性成分的小分子配体2D 结构和靶点蛋白的结构，导入Autodock vina 软件进行对接。

2 结果

2.1 柴胡桂枝汤有效活性成分筛选及靶点预测

共检索到柴胡桂枝汤9 味药材的有效活性成分234 个，其中柴胡17 个、桂枝7 个、白芍13、黄芩36 个、人参22 个、半夏13 个、生姜5 个、大枣29 个、甘草92 个，去重后共获得204 个有效活性成分，筛选到相应作用靶点250 个。

2.2 药物靶点与疾病靶点交集

经分析得到药物潜在活性成分靶点250 个，抑郁症疾病基因8197 个，二者得出的交集靶点基因为199 个。见图1。

图1 药物和疾病交集靶点

2.3 活性成分-疾病靶点相互作用网络

柴胡桂枝汤活性成分-疾病靶点相互作用网络图见图2。图中共有354 个节点，其中来源于化合物共154 个，来源于基因共199 个。经统计度值较高的有效成分为槲皮素、山柰酚、汉芩黄素等。见表1。

表1 柴胡桂枝汤度值前5 位化学成分

图2 活性成分-疾病靶点相互作用网络图

2.4 PPI 网络及核心基因预测

PPI 网络图共有199 个节点、777 条边，邻接节点数目越多，说明这些蛋白在网络中的作用越显著。见图3。经拓扑分析筛选后关键基因有JUN、Akt1、ESR1等15 个靶点。见图4。

图3 交集基因蛋白质-蛋白质相互作用网络图

图4 蛋白质-蛋白质相互作用网络拓扑分析核心基因

2.5 GO 富集分析和KEGG 通路分析

GO 富集分析共得到2900 条富集结果，其中生物过程2545 个，细胞组分127 个，分子功能228 个，根据P 值各取前10 条富集结果绘制GO 条形图进行展示，见图5。KEGG 通路富集分析共得到170 条通路富集结果，主要涉及感染、炎症、免疫等多条通路，根据P 值取前30 条通路富集结果绘制KEGG 气泡图进行展示，见图6。在对KEGG 结果进行预读后发现，与柴胡桂枝汤治疗抑郁症密切相关的通路有MAPK、PI3K-Akt 信号通路。

图5 交集基因GO条形图

图6 交集基因KEGG气泡图

2.6 潜在活性成分-疾病靶点分子对接分析

分子之间结合能量较低的构象较为稳定，对接结果结合能均＜-7.0 kcal/mol，其中山柰酚与Akt1 对接结合能最低，展现出良好的结合力，见图7。分子对接结果见表2。

表2 关键化合物与核心靶点分子对接结合能（kcal/mol）

图7 山柰酚与Akt1 分子对接图

3 讨论

柴胡桂枝汤临床应用广泛，为深入研究其治疗抑郁症的作用机制，本研究采用网络药理学的方法，共筛选得到154 个活性成分及250 个作用靶点，通过构建活性成分-疾病靶点相互作用网络对柴胡桂枝汤治疗抑郁症的主要活性成分、重要靶点及潜在机制进行分析。本研究发现，槲皮素、山柰酚、汉黄芩素等化合物度值较大，对应多个抑郁症靶点，可能是柴胡桂枝汤治疗抑郁症的主要活性成分。其中槲皮素作为一种天然的多羟基黄酮化合物，可通过抗氧化、抗炎、降低兴奋性毒性、升高5-羟色胺水平来发挥抗抑郁作用[12]。山柰酚具有神经保护作用，可抑制抑郁症大鼠海马神经元凋亡并促进神经再生，通过抗氧化应激、抑制炎症因子分泌和上调蛋白激酶B/β-联蛋白等途径发挥抗抑郁作用[13]。通过PPI 网络拓扑分析后筛选到JUN、Akt1、ESR1、MAPK3 等15 个靶点，提示这些靶点在PPI 中发挥了关键作用，可能是柴胡桂枝汤治疗抑郁症的核心基因。免疫炎症反应与神经细胞受损、凋亡在抑郁症的发生发展中起着关键作用。研究表明[14]，转录因子AP-1（JUN）在炎症与细胞凋亡等应激反应中发挥重要作用；有研究报道[15]，著名抗抑郁药氟西汀是通过提高海马Akt1 的表达并促进Akt 激酶磷酸化而发挥抗抑郁作用。雌激素水平的高低与抑郁症密切相关，雌激素可通过作用于ESR1 调节多种与抑郁症相关的中枢神经递质水平[16]。MAPK 可促使c-JUN磷酸化而启动细胞凋亡，这可能是MAPK 发挥抗抑郁作用的重要途径[17]。此外，这些靶点均对应了多个活性成分，如MAPK14 来自汉黄芩素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮等51 个活性成分，这提示柴胡桂枝汤具有多成分、多靶点协同抗抑郁的作用。

GO 功能富集分析结果主要涉及对脂多糖的反应、氧化应激反应等生物过程的调节。其中，氧化应激反应可通过上调氧自由基水平、降低抗氧化水平，对生物膜、核酸、细胞凋亡产生影响等多种途径参与抑郁症的发病过程[18]。KEGG 通路分析结果显示，柴胡桂枝汤作用于抑郁症的靶点主要涉及MAPK、PI3K-Akt信号通路等。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）可改变海马结构和功能，抗抑郁药的使用与调节患者BDNF 水平密切相关[19]。MAPK 信号通路存在于人体大多数细胞内，具有广泛的生理病理调节作用，是BDNF 下游信号通路中与抑郁症关系最密切的一条，可通过影响和调节海马神经突触的可塑性、长时程增强效应及介导神经营养因子、生长因子发挥抗抑郁作用[20-22]。分析提示，柴胡桂枝汤与MAPK 信号通路相关的靶点共有34 个，包括经PPI 网络拓扑分析后筛选得到的JUN、RELA、Akt1等多个核心基因，由此推测通过调控MAPK 信号通路或为防治抑郁症的主要机制之一。PI3K-Akt 信号通路高表达可有效调控海马神经元凋亡、再生，影响海马神经突触的可塑性，进而起到抗抑郁的作用[23-24]。此外，PI3K-Akt 信号通路还可通过促进神经营养因子释放、调节谷氨酸能系统功能、改善线粒体功能异常、调节糖和脂质代谢紊乱等途径参与抑郁症的发生发展[25]。同时有众多关键靶点如RELA、Akt1、MYC、MAPK1 等富集在PI3K-Akt 信号通路上，提示该通路在抗抑郁过程中起到纽带作用。

最后，利用分子对接技术选取柴胡桂枝汤度值最高的3 个主要有效成分（槲皮素、山柰酚、汉黄芩素）与关键核心靶点MYC、Akt1、ESR1、MAPK14、JUN 进行分子对接结合，结果显示结合能均≤-7.0 kcal/mol，匹配能量较低，提示小分子与大分子结合的构象稳定，结合性好，展现出良好的结合力，也部分验证了本研究结果。

综上所述，柴胡桂枝汤可能通过槲皮素、山柰酚等主要活性成分作用于JUN、Akt1、ESR1、MAPK3 等关键靶点，通过参与对脂多糖的反应、氧化应激反应等多种生物学过程，激活或抑制MAPK、PI3K-Akt 等主要信号通路，产生调节神经类递质的释放和传递、调控海马神经元凋亡和再生、介导神经营养因子和生长因子等功效，从而发挥抗抑郁作用。柴胡桂枝汤治疗抑郁症的作用机制是一个多基因、多生物过程调节及多通路共同参与的过程，符合中药治疗疾病多成分、多靶点的特征。本研究通过网络药理学和分子对接技术，初步预测柴胡桂枝汤对抑郁症的主要有效成分、作用靶点、相关通路及协同作用的分子机制，为后续进一步开展药物机制研究、药物开发及临床试验等奠定基础和提供了理论依据。