25种药剂处理对西瓜种传细菌性果斑病菌的抑制效果

唐思琪 孙小武 何长征 兰相祎 蔡雁平 戴思慧

摘    要：細菌性果斑病是一种为害西瓜生产的种传病害，病原菌为西瓜噬酸菌，种子消毒是防治细菌性果斑病的首要措施。采用平板抑菌圈法从25种杀菌剂中筛选出8种对西瓜噬酸菌抑菌效果好的药剂，其中5000 mg·L-1杀菌剂1号AS平均抑菌圈直径最大;用这些药剂对带菌西瓜种子进行处理，结果表明，5000、2500、1250 mg·L-1的杀菌剂1号AS，1000、2000 mg·L-1的25%寡糖·乙蒜素ME，100 000 mg·L-1的80%乙蒜素EC和300、150 mg·L-1的3%噻霉酮WP都有较好的杀菌效果，其中25%寡糖·乙蒜素ME和杀菌剂1号AS虽有杀菌作用，但浓度过高会影响种子萌发;100 000 mg·L-1 80%乙蒜素EC处理的种子发芽率与对照相比提高了22.22%，300、150 mg·L-1的3%噻霉酮WP处理的种子发芽率分别比对照提高58.73%、53.97%。试验结果表明，乙蒜素和噻霉酮对西瓜嗜酸菌有抑菌作用的同时不会抑制种子萌发，噻霉酮促生效果更佳，可初步作为防治细菌性果斑病的种子处理剂。

关键词：西瓜;细菌性果斑病;平板抑菌法;种子处理;杀菌剂

中图分类号：S651+S482.2 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）11-017-07

Inhibitory effect of 25 bactericide on watermelon bacterial fruit blotch by seed treatment

TANG Siqi， SUN Xiaowu， HE Changzheng， LAN Xiangyi， CAI Yanping， DAI Sihui

（Hunan Agricultural University College of Horticulture， Changsha 410128， Hunan， China）

Abstract： Bacterial fruit blotch（Acidovorax citrulli） is a highly harmful seed-borne disease on watermelon. Once the disease occurs， it will cause serious loss of watermelon production. Seed disinfection is the first measure to prevent and control bacterial fruit blotch. In this experiment， the plate inhibition zone method was used to screen out 8 agents with good antibacterial effect on AC from 25 fungicides.Among them， 5000 mg·L-1 fungicidal No.1 had the largest average bacteriostatic zone. After the treatment of watermelon seeds with these agents， it was found that 5000 mg·L-1， 2500 mg·L-1， 1250 mg·L-1 fungicide AS， 1000 mg·L-1 and 2000 mg·L-1 25% oligosaccharide Elicin ME，The 100 000 mg·L-1 80% acetallicin EC， 300 mg·L-1 and 150 mg·L-1 3% thiamethanone WP showed good germicidal effect on new seeds. Although 25% oligosaccharide · acetallicin ME and fungicide No.1 AS had germicidal effect， they would inhibit new seed germination with too high concentration.Compared with the control， the germination rate of 100 000 mg·L-1 80% ethyl allicin EC was increased by 22.22%， and the 3% thiamethanone WP of 300 mg·L-1 and 150 mg·L-1 were increased by more than 50%. Moreover， the germination of seeds was obviously promoted by 80% ethyl allicin EC. It was found that both ethicallin and thiamelone had antibacterial effect on acidophagocytes and did not inhibit new seed germination， thiamelone had better effect on promoting growth and could be used as seed treatment agent for preventing and controlling bacterial fruit blotch.

Key words：Watermelon; Bacterial fruit blotch; Plate bacteriostatic method; Seed treatment; Bactericide

细菌性果斑病（Bacterial fruit blotch，BFB）是为害西甜瓜的重要病害之一，也是我国对内和对外的检疫对象，其病原菌是西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli，Ac），属于革兰氏染色阴性菌，是一种活体营养型细菌。该病是典型的种传病害，严重影响瓜果品质和产量，在很多国家和地区都有发生。目前，在我国的河南、内蒙古、山东、陕西、甘肃、新疆、海南等省（自治区）均有该病的报道[1]。Ac不仅能侵染葫芦科作物，在番茄、茄子等茄科植物的种子中、与西瓜套种的甘薯中也曾被检测到[2-3]。西瓜的苗期和成株期皆可发病，染病初期子叶和叶缘会出现坏死斑点，随后感染真叶形成病斑，果实染病后果皮会出现斑点逐渐扩大成片状并深入果肉，感病处可能会出现白色的细菌分泌物或渗出物并伴随着其他杂菌侵染，最终造成全果腐烂[3]。BFB主要的带菌媒介是种子，其次是感病植株、果实、土壤等，其可附着在种子表面，并可在种皮下外胚乳层存活4～5个月[4]。染菌种子是该病害远距离传播的主要途径，建立安全有效的种子消毒处理技术是防控瓜类细菌性果斑病的首要环节。

目前，生产中常用的防治细菌性果斑病的种子处理方法有物理防治和化学防治。物理防治中干热处理是较常见的方式，通常将种子70 ℃干热处理72 h，对种子外部和内部的病菌都有一定的消毒作用[5-6]，也有人将处理温度提高至75 ℃，处理时间缩短至48 h就可以完全杀灭西瓜细菌性果斑病菌，且不抑制种子萌发[7]。但干热处理受种子颗粒大小限制，且会影响种子的耐贮藏性，不宜久放[5]，只能当年种，所以物理消毒并不是最广泛的应用方法。化学药剂处理是防治种子带菌的主要措施之一，通常在播种前用40 %甲醛、盐酸、双氧水、过氧乙酸、酸性电解水浸泡西瓜种子达到杀菌目的[3，8]，这种方法操作简便，成本低，但由于药剂本身的毒性，杀菌效果强的药剂可能会抑制种子萌发，甚至给周围环境以及人畜带来污染。

笔者选择了常用于防治细菌性病害的25种药剂，并对其进行抑菌、种子发芽指标测定，以期筛选出安全高效的种子杀菌处理剂，为该病害的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试品种为黑媚娘有籽西瓜种子，由湖南雪峰种业有限公司提供。供试病原菌：西瓜噬酸菌菌株（Ac），由中国农业科学院植物保护研究所提供。供试培养基：KB培养基（蛋白胨20 g·L-1，琼脂18 g·L-1，硫酸镁1.5 g·L-1，磷酸二氢钾1.5 g·L-1，甘油10 mL·L-1），制做平板时加15 mg·L-1氨苄青霉素。供试药剂见表1。

1.2 方法

试验于2020年 8—11 月在湖南农业大学蔬菜瓜类研究所内进行。

1.2.1 染菌种子制备 （1）西瓜噬酸菌菌悬液制作。在超净工作台操作，用无菌接种环从KB固体培养基上挑取少许培养48 h左右的Ac单菌落，轻弹于装了35 mL KB液体培养基的无菌离心管中，密封好，置于28 ℃摇床220 r·min-1振荡培养48 h，用分光光度计测定OD600值，达到0.6左右备用。（2）制备染菌种子。采用针刺接种法，即用75%酒精将已成熟的健康黑媚娘西瓜果实表皮消毒后，用无菌刀片切开大小为4 cm×4 cm的小孔，将配制好的菌悬液用无菌注射器注入西瓜内部，然后用保鲜膜封住西瓜表皮伤口，28 ℃温度下放置2～4 d，西瓜表皮出现病斑后，即为发病，可收获染菌种子，洗净风干后备用。（3）试纸条初筛。使用燕麦嗜酸菌检测试纸条AISK14800/0025进行检测，将20粒染菌西瓜种子放入装有20 mL无菌水的锥形瓶中，置于28 ℃摇床220 r·min-1振荡培养4 h后倒入样品袋，将试纸条放入样品袋中，30 min后观察结果，测试线与质控线皆呈现红色则为阳性，表示种子表面带有Ac[9]。（4）PCR法。将（3）中的菌液作为PCR模板[10-11]，使用特异性引物WBF1、WBF2对Ac进行扩增，引物由长沙博仪生物技术有限公司合成。PCR反应体系：上下游引物各1 μL，Taq PCR MasterMix 10 μL，无菌水7 μL，模板1 μL，共20 μL。扩增程序：98 ℃预变性3 min，98 ℃变性10 s，62 ℃退火10 s，72 ℃延长30 s，35个循环;72 ℃再延长5 min，4 ℃保存。（5）苗期观察。随机选取45粒染菌西瓜种子播种于规格为5×10孔的穴盘中，使用保湿盒隔离，放置于室外生长（温度22～28 ℃），观察并记录发病状况。以健康西瓜种子在同一条件下播种作为对照。

1.2.2    平板抑菌法筛选药剂    将待测药剂用纯水稀释4个浓度备用。挑取Ac单菌落接种于KB液体培养基中，置于28 ℃摇床220 r·min-1振荡培养36 h，用无菌水将菌悬液浓度调至OD600 0.3～0.4（OD600 0.3=108 cfu·mL-1）[12]备用。将制备好的菌悬液和降温至40～45 ℃的KB培养基按1∶10混匀，每个培养皿倒入约20 mL的混菌KB培养基，凝固备用。每个混菌培养基中放入4片直径5 mm的灭菌滤纸片，让其轻轻贴附于平板表面，其中3片分别滴入10 μL相同浓度的药剂，1片滴入10 μL无菌水作为阴性对照，每个药剂浓度3次重复，即每个药剂浓度设置3个平板培养皿。将封好的培养皿放入28 ℃恒温箱培养20 h后，用十字交叉法（两条直径的平均值）测量抑菌圈直径，平均抑菌圈直径为5 mm时表明药剂无抑菌作用，大于5 mm则表示有抑菌作用。试验数据采用Excel 2007、SPSS.26软件处理。

1.2.3    药剂处理染菌种子的检测    通过以上平板试验筛选得到有显著抑菌效果的藥剂对西瓜种子进行处理，进一步测定种子带菌量和萌发情况，用不同浓度的药剂浸泡染菌种子20～30 min，而后用流水冲洗10 min左右，以清水处理种子作为对照，每个处理50粒种子，处理后阴干备用。其中20粒进行种子表面带菌量检测，将种子分别浸泡于装有20 mL无菌水的锥形瓶中，加入2～3滴吐温-20，封口后放置于4 ℃冰箱24 h。取上述种子浸泡液20 μL涂布于含有15 mg·L-1氨苄青霉素的KB固体培养基中，28 ℃培养48 h后统计菌落量，每个处理3次重复。取30粒种子进行发芽试验，每10粒为1次重复，将种子放于9 mm培养皿内的湿润滤纸上，滤纸下面放适量干净的白沙用于保湿，并在种子上加盖一层湿润的滤纸。放入28 ℃恒温培养箱黑暗培养，每12 h加水1次，保证种子湿润，每隔24 h拍照统计，3 d揭掉表面覆盖的滤纸并统计发芽势，5 d测定根长计算活力指数，7 d测定发芽率。

测定公式：（1）种子表面菌落量测定，N代表每个培养皿上的菌落个数[1]。

-代表N=0;

+代表0<N≤10;

++代表10<N≤100;

+++代表100<N≤500，能看清单菌落;

++++代表N>500，菌落连成一片。

（2）发芽指标测定

发芽势/%=3 d种子发芽数/供试种子数×100;

发芽率/%=7 d发芽种子数/供试种子数×100;

发芽指数=∑ Gt/Dt;

活力指数=发芽率×根长。

其中，Gt为7 d内每日发芽数，Dt为发芽日数。

2 结果与分析

2.1 染菌种子验证

从图1可看出，接种4 d后西瓜表皮出现明显病症。由图2可知，采用试纸条对染菌种子进行检测，检测样本与阳性对照试纸条的测试线皆显示红色，表明样本上携带Ac。

由图3可知，以染菌种子液作为模板，对Ac特异性引物WBF1、WBF2扩增出来的PCR产物进行琼脂糖电泳检测，结果显示无菌水对照无条带，而染菌种子液均扩增到条带，条带大小为462 bp，与阳性对照位置条带大小一致，表明种子表皮存在Ac。

播种后每隔5 d观察西瓜幼苗，染菌西瓜种子的幼苗子叶首先出现圆形晕圈小点，真叶长出后，也出现多个圆形斑点，对照未发现上述症状。取发病叶片样品进行细菌分离试验，证明确为Ac（图4）。

综上所述，分别用试纸条法、PCR扩增法、苗期观察法，确定了采用针刺法接种病原菌于健康西瓜，可以模拟自然侵染环境，获得带菌的西瓜种子。

2.2 不同药剂的平板抑菌效果

由表2可知，在平板抑菌筛查试验中，72%链霉素WP、46%氢氧化铜WG、枯草芽孢杆菌（第一细）AS、地衣芽孢杆菌DP、50%多抗·喹啉铜WP、20%吗胍·乙酸铜WP、47%春雷·王铜WP、45%精甲霜灵·王铜WP、20%噻菌铜SC、20%噻唑锌SC、30%噻唑锌SC和20%噻森铜SC等12种药剂的平均抑菌圈直径均为5 mm，与CK相同，为无效抑菌圈，表明这12种杀菌剂在试验条件下对Ac完全没有抑制效果。解淀粉芽孢杆菌DP、枯草芽孢杆菌DP、40%喹啉铜SC、15%恶霉灵AS、50%氯溴异氰尿酸SP等5种药剂对Ac有较小的抑制效果，最高浓度的平均抑菌圈直径均小于10 mm，随着供试浓度的降低，抑菌效果逐渐消失;8%春雷·噻霉酮WG、杀菌剂1号AS、3%噻霉酮WP、0.3%四霉素AS、5%春雷·中生WP、25%寡糖·乙蒜素ME、80%乙蒜素EC和荧光假单胞杆菌DP等8种药剂随着药剂浓度的增加，平均抑菌圈直径呈现正增长，最高浓度的平均抑菌圈直径均大于10 mm。

由表3可知，筛选出平均抑菌圈直径大于10 mm的有效药剂及其浓度，即质量浓度（ρ，下同）為80 000 mg·L-1的8%春雷·噻霉酮WG，5000、2500、1250 mg·L-1的杀菌剂1号AS，300、150 mg·L-1的3%噻霉酮WP，3000、1500 mg·L-1的0.3%四霉素AS，50 000、25 000 mg·L-1的5%春雷·中生WP，2000 mg·L-1的25%寡糖·乙蒜素ME，100 000、50 000 mg·L-1的80%乙蒜素EC和10×106、40×105、20×105 mg·L-1的荧光假单胞杆菌DP。将此8种有效药剂及其供试浓度和清水对照进行邓肯分析可知，此8种药剂对Ac的抑菌效果均与对照达到显著差异水平。其中，5000 mg·L-1杀菌剂1号AS抑菌效果最好，其次是10×106  mg·L-1荧光假单胞杆菌DP。

2.3 不同药剂处理西瓜染菌种子的结果

将以上平板试验筛选得到的抑菌效果达到显著差异的8种药剂进行进一步发芽试验（表4），剔除发芽率为0的药剂，筛选得到杀菌剂1号AS、25 %寡糖·乙蒜素ME、80%乙蒜素EC、3 %噻霉酮WP、5%春雷·中生等5种药剂对西瓜种子进行处理。由表4可知，5%春雷中生WP处理染菌种子后，平板菌落量最低的均大于10个，效果最差，这与平板抑菌试验中表现的结果不一致，也反映出室内抑菌试验的局限性。5000、2500、1250 mg·L-1的杀菌剂1号AS，1000、2000 mg·L-1的25%寡糖乙蒜素ME，100 000 mg·L-1的80%乙蒜素EC和300、150 mg·L-1的3%噻霉酮WP的平板菌落量均为0，这4种药剂及其有效浓度在平板抑菌和实际处理染菌种子中都表现出较好的杀菌效果。在种子萌发方面，当25 %寡糖·乙蒜素ME的供试浓度越高时，种子发芽率就越低，供试最高浓度无发芽种子;杀菌剂1号AS对种子杀菌效果最好，但对种子萌发有抑制;与对照相比，100 000 mg·L-1 80%乙蒜素EC处理种子后发芽率提高22.22%，活力指数提高100.93%;300、150 mg·L-1的3%噻霉酮WP处理种子的发芽率与对照相比分别提高58.73%、53.97%，活力指数均高于对照。综上所述，高浓度的噻霉酮对细菌性果斑病有明显的抑制效果，同时对种子发芽没有影响，反而对种子有明显的促生效果。

3 讨论与结论

在试验中研究者们多数使用浓度1×108～3×108 cfu·mL-1的菌液浸泡种子1～2 h来制备染菌种子[11]，这种方法快速简便。在本试验中使用了试纸条法、PCR法、幼苗检测法3种方法检测针刺法接种病原菌于健康西瓜中的侵染效果，使用针刺法接种西瓜可以模拟自然侵染环境，使西瓜表皮出现病症，造成果实内部腐烂、西瓜种子感染病原菌。由此表明，针刺法接种健康西瓜可用于不确定病原菌是否有活性的情况，3 d左右即可观察到西瓜发病状况，同时能够达到观察病原菌的致病性和制备染菌西瓜种子的目的。

笔者采用室内平板抑菌圈法比较了不同杀菌剂对Ac的平板抑菌效果与处理染菌种子的杀菌效果。试验结果表明，46%氢氧化铜WG、20%吗胍·乙酸铜WP、47%春雷霉素·王铜WP、45%精甲霜灵·王铜WP、20%噻菌铜SC和20%噻森铜SC等铜制剂在平板抑菌试验中对Ac没有表现出抑菌效果。不过有些铜制剂在西甜瓜苗期和成株期使用，能够起到一定防治作用[12]。也有学者发现纳米级铜制剂（硫酸铜、氢氧化铜）在一定浓度时能对Ac产生抑菌作用，其中氢氧化铜效果最佳，能够使菌体出现孔洞、扭曲变形等破损现象[13]，使用纳米级原料或许是农药制药的一个新方向。生物菌型药剂地衣芽孢杆菌DP、枯草芽孢杆菌DP、抗生素型生物药剂72%链霉素WP对Ac没有抑菌效果，这与现有的枯草芽孢杆菌和链霉素防治Ac的报道有差异[14]，猜测是由于不同厂家生产、菌株差异造成的。通常在平板抑菌试验中，不同生产厂家、同一厂家同一药剂的不同剂型都有可能导致试验结果存在差异[1]。荧光单胞杆菌DP、解淀粉芽孢杆菌DP、25%寡糖·乙蒜素ME、80%乙蒜素EC、5%春雷·中生WP在平板抑菌试验中表现出一定的抑菌效果，但在实际处理种子后，对种子的杀菌作用不理想，王爽等[1]使用3种药剂处理带菌西甜瓜种子时，也发现在平板抑菌效果好的药剂在实际处理种子后防效反而不如其他2种药剂，这皆反映出平板抑菌的结果不能代表实际处理种子后的效果，存在一定的局限性。在本试验中统一了药剂浸泡种子、流水冲洗种子的时间，春雷·中生菌素WP和四霉素AS在平板抑菌和处理染菌种子中都对Ac表现出较好的杀菌效果，但发现处理后的种子萌发率相比对照有所降低;杀菌剂1号AS、3%噻霉酮WP、25%寡糖乙蒜素ME、80%乙蒜素EC在平板抑菌和处理染菌种子时都有较好的抑菌作用，其中杀菌剂1号AS在平板抑菌中表现最好，这与谢慧婷等[15]的结果相似，但本试验中会影响种子萌发，推测是流水冲洗不充分的原因。本试验仅探究了同一处理方式下药剂对种子的影响，使用不同的时间处理种子或延长流水冲洗时间，种子萌发都可能出现差别。噻霉酮是一种有机杂环类杀菌剂，杀菌谱广，对水稻白叶枯病、黄瓜霜霉病、杧果炭疽病等细菌、真菌病害都有很好的防治效果[16-17]，同时具有低毒、高效、安全、广谱、低残留等特点。

在种子杀菌处理剂中，单剂的作用不够全面，搭配得当的二元混配制剂可增强防治效果、中和药剂伤害、扩大杀菌范围和克服病菌抗性[18]。目前，与噻霉酮复配的农药剂型有水分散剂型[19]、乳剂[20]等，大多是用于叶面防治，在建立安全高效杀菌的种子处理技术中，可通过选择合适的药剂与噻霉酮混用，也许可以得到更广谱、稳定的杀菌效果的种子处理剂。

综上所述，3%噻霉酮WP对种子萌发有一定的促进作用，供试最高浓度的发芽率相比对照提高58.73%，有明显促生作用，可作为防治细菌性果斑病的种子处理剂。

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