一株野生多脂鳞伞的鉴定、人工栽培与营养成分分析

陈润臣，王艺凝，刘潇文，王红艳，丁 强，王鸿磊

(中国农业大学烟台研究院，山东 烟台 264670)

随着生活水平的提高，人们对健康、绿色食品的要求越来越高。食用菌因其味道鲜美、营养丰富，且具有一定的保健和药用功能[1-2]，越来越受人们的欢迎[3]，联合国粮食及农业组织和世界卫生组织更将其纳入“一荤一素加一菇”的合理膳食结构中[4]。

鳞伞属[Pholiota(Fr.)P.Kumm.]属于担子菌门(Basidiomycota)层菌纲(Hymenomycetes)伞菌目(Agaricales)球盖菇科(Strophariaceae)，广泛分布于世界各地，目前中国境内记录有63个种(包括亚种)[5]。鳞伞属真菌是重要的食药用菌资源，2019年我国小孢鳞伞(滑菇)的产量超过30万t，成为我国13个食用菌主栽品种之一[6]。除小孢鳞伞外，我国可供食用的鳞伞属真菌还有多脂鳞伞、黄鳞伞、金毛鳞伞、高地鳞伞等17个种[7-10]，其中，多脂鳞伞、黄鳞伞、粘鳞伞等9个种具有抗细菌、抗肿瘤、降血脂、提高机体免疫力等药用价值[11-13]。然而目前我国除小孢鳞伞外，尚无大规模栽培其他鳞伞属真菌的报道。

笔者于山东省栖霞市一苹果园中采集到一个野生鳞伞属真菌子实体，通过纯种分离获得了菌种。本文通过对该鳞伞属真菌子实体、菌丝、孢子等的形态学观察和分子生物学鉴定，确定了其分类地位，研究了其生物学性质，通过栽培试验获得了子实体，并对子实体的营养成分进行了测定，以期为野生多脂鳞伞的人工栽培、液体发酵、活性物质提取等开发利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 鳞伞属真菌

于栖霞市苹果园苹果树上采集到一个鳞伞属真菌子实体，取菌盖和菌柄连接处的菌丝组织接种于PDA平板上，25 ℃培养获得菌种，编号为EF-3。

1.1.2 培养基和栽培料

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉15 g、蒸馏水100 mL，pH值自然。

pH试验培养基：PDA培养基灭菌后，用过滤除菌的NaOH溶液和HCl溶液调pH值至4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。

碳源试验培养基：土豆浸粉10 g，MgSO40.5 g，琼脂20 g，水1 000 mL，碳源分别为2%的葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米粉、红糖、糖蜜、纤维素、麦芽糖和乳糖。

氮源试验培养基：蔗糖20 g，MgSO40.5 g，琼脂20 g，水1 000 mL，氮源分别为1%的酵母浸粉、土豆浸粉、牛肉浸粉、蛋白胨、豆饼粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨和0.5%的氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾。

无机盐试验培养基：蔗糖20 g，豆饼粉10 g，琼脂20 g，水1 000 mL，无机盐分别为0.1%的MgSO4、MnSO4、NaCl、CaSO4、FeSO4、K2HPO4、KH2PO4、Na2SO4、ZnSO4和K2SO4。

二级种培养料：麦粒90%、麸皮10%。新鲜麦粒煮至熟而不烂，加入麸皮拌匀，装入菌种瓶，121 ℃灭菌150 min。

栽培料：玉米芯32%、木屑50%、麸皮15%、石灰1%、碳酸钙1%、蔗糖1%。原料混匀后加水至含水量60%，放置2 h，装袋，121 ℃灭菌150 min。

1.2 方法

1.2.1 鳞伞属真菌EF-3的鉴定

子实体形态学观察：参照文献[14]的方法观察子实体的形状、颜色、鳞片、菌褶、菌柄等形态结构特征并拍照。

菌丝、无性孢子观察：将菌种接种于PDA培养基平板上，25 ℃培养。挑取菌丝体，用美兰染色液制作水浸片，观察菌丝、锁状联合和无性孢子[15]。

孢子印制备：取新鲜的子实体，用刀片齐菌褶把菌柄切断，把菌盖扣在硫酸纸上，扣上玻璃罩，2～4 h后，担孢子散落在纸上，即得孢子印[14]。

担孢子观察：取少量担孢子，于奥林巴斯BX51光学显微镜下观察担孢子形态并拍摄照片。取冻干的子实体1个、干燥的担孢子少许，用导电胶带固定到样品台上，在表面喷镀一层导电金，JSM-7610F扫描电子显微镜观察担孢子形态并拍摄扫描图片[16-17]。

分子生物学鉴定：取子实体0.1 g，用CTAB法提取基因组DNA，使用真菌28S rDNA通用引物NL1(GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG)、NL4(GGTCCGTGTTTCAAGACGG)扩增28S rDNA的D1、D2区[18]。PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，所得基因序列通过Blast程序与Genbank数据库的序列比对，进行分子生物学鉴定。用MEGA 5.0进行多序列比对并构建系统发育树。

1.2.2 生物学特性研究

最适生长温度试验：用内径8 mm打孔器打取菌落边缘的菌丝块，接种于PDA培养基平板表面，分别在5、10、15、20、25、30、35 ℃培养，定期测量菌落直径，计算菌丝生长量。

最适pH值试验：用内径8 mm打孔器打取菌落边缘的菌丝块，接种于pH试验培养基平板表面，定期测量菌落直径，计算菌丝生长量。

最佳碳源、氮源、无机盐试验：用内径8 mm打孔器打取菌落边缘的菌丝块，分别接种于碳源试验培养基、氮源试验培养基、无机盐试验培养基表面，25 ℃培养，定期测量菌落直径，计算菌丝生长量。

1.2.3 栽培试验

将菌种接种到PDA平板上，25 ℃培养7 d得栽培母种。取4～5块母种接种到麦粒培养基上，24 ℃培养得二级种。将二级种接种到栽培料上，24 ℃培养至产生黄色液滴，打开袋口去掉老菌皮，给予温差刺激，维持相对湿度85%～95%，每天早晚喷水各1次，喷水后通风30 min直至现蕾，观察出菇过程。

1.2.4 营养成分分析

多脂鳞伞EF-3子实体60 ℃干燥后，依据GB5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》、GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》、GB/T 15672—2009《食用菌中总糖含量的测定》、NY/T 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的测定》和GB5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》测定子实体中的蛋白质、脂肪、总糖、多糖和游离氨基酸含量。

1.3 数据分析与绘图

利用SPSS 19.0软件对试验数据进行显著性分析和多重比较，利用Origin 9.1软件进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 鳞伞属真菌EF-3的鉴定

2.1.1 子实体形态学观察

鳞伞属真菌EF-3菌盖初期扁半球形，后期平展、黄色，具丛毛状三角形鳞片。鳞片同心圆排列，菌盖中央颜色较深。鳞片与菌盖结合处黄色至褐色，尖端白色至浅黄色(图1-A)。菌盖湿时黏，鳞片清洗易脱落。

菌柄浅黄色，中生或近中生，近等粗(图1-B)，内实，横切面水渍状斑点(图1-C)。菌环丝膜状，菌盖边缘残留菌幕残片(图1-D)，菌环以下菌柄上有淡黄色鳞片，菌环以上光滑(图1-B)。

菌肉浅黄色，菌肉与菌柄内部颜色一致(图1-E)。菌褶密，浅黄色，成熟后浅褐色，弯生、不等长、不分叉(图1-B)。

A，菌盖正面；B，菌盖背面；C，菌柄横切；D，内菌幕和菌褶；E，子实体纵切。

一个担子上4个担孢子(图2-A)，担孢子肾形，顶部有孔口，向内弯曲(图2-B)，大小(5.5～7.5)μm×(3.5～5.0)μm，长宽比约1.2～2.0(图2-C)。孢子印褐色(图2-D)。

图2 担孢子和孢子印

2.1.2 菌落和菌丝形态观察

鳞伞属真菌EF-3菌落呈规整的圆形，蔓延生长，棉絮状，质地疏松，菌落表面有同心轮纹。菌落无色至淡黄色，中心颜色略深于四周，不产水溶性色素(图3-A)。菌丝多分枝，直径1.5～3.5 μm，具锁状联合(图3-B)。平板培养3 d左右产无性孢子，孢子大小(7.5～13.75)μm×(2.25～4.25)μm(图3-C)。

2.1.3 分子生物学鉴定

利用CTAB法提取鳞伞属真菌EF-3基因组DNA，用引物NL1、NL4扩增28S rDNA的D1、D2区。PCR产物送生工生物(上海)股份有限公司进行序列测定。Blast序列相似性比对结果显示：鳞伞属真菌EF-3的28S rDNA的D1、D2区序列与多脂鳞伞(Pholiotaadiposa)的相关序列相似率均高达98%以上，结合形态学指标鉴定其为多脂鳞伞。多脂鳞伞EF-3与鳞伞属其他种的系统发育树如图4所示。

2.2 生物学特性

2.2.1 最适生长温度

如图5所示，多脂鳞伞EF-3菌丝在5 ℃生长极其缓慢，随着温度的升高，其菌丝生长加快，当培养温度提高到25 ℃时菌丝生长最快。培养温度超过25 ℃时菌丝生长速度急剧下降，培养温度提高至35 ℃时菌丝几乎不生长。

柱上无相同字母的表示差异显著(P<0.05)。下同。

2.2.2 最适生长pH值

如图6所示，多脂鳞伞EF-3菌丝在pH值4.5～11.0均可生长，其最适pH值为5.0，当pH值超过5.0时，菌丝生长速度缓慢降低，至pH值为11时菌丝仍能保持较快的生长速度。

图6 多脂鳞伞EF-3在不同pH值下的菌丝生长量

2.2.3 最适碳源

碳源是多脂鳞伞最重要的营养物质，可为多脂鳞伞的生长提供碳元素和能量。多脂鳞伞EF-3能利用的碳源谱较广泛(图7)，无论是大分子的纤维素、淀粉，还是小分子的葡萄糖均能被菌丝吸收。但多脂鳞伞菌丝在不同碳源培养基上生长速度不同，其中，在乳糖为碳源的培养基上生长最慢，在以蔗糖、红糖为碳源的培养基上菌丝生长最快。

A，葡萄糖; B，蔗糖; C，淀粉; D，玉米粉; E，红糖; F，糖蜜; G，纤维素; H，麦芽糖; I，乳糖。

2.2.4 最适氮源

氮是构成蛋白质、核酸等生物大分子的重要元素，也是维生素、氨基酸等活性物质合成的基础。从图8可以看出，多脂鳞伞EF-3可利用的氮源非常广泛，不管是无机氮源还是有机氮源都能很好地利用。总体上看，多脂鳞伞EF-3在有机氮源培养基上的生长速度明显高于无机氮源培养基。菌丝在不同有机氮源培养基上生长速度也有明显差异，其中，以豆饼粉为氮源的培养基最利于菌丝生长。

A，氯化铵；B，硫酸铵；C，硝酸铵；D，硝酸钾；E，酵母浸粉；F，土豆浸粉；G，牛肉浸粉；H，蛋白胨；I，豆饼粉；J，胰蛋白胨；K，大豆蛋白胨。

2.2.5 最适无机盐

结果(图9)表明，培养基内添加不同无机盐对多脂鳞伞EF-3菌丝生长有不同的作用。硫酸锰对菌丝生长具有明显促进作用，而培养基内添加0.1%硫酸钾、硫酸钠等无机盐后，多脂鳞伞EF-3菌丝生长明显受到抑制。硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸钙等无机盐的加入对多脂鳞伞EF-3菌丝的生长没有明显作用。

图9 多脂鳞伞EF-3在不同无机盐下的菌丝生长量

2.3 多脂鳞伞EF-3栽培实验

将多脂鳞伞EF-3母种接种到麦粒二级种培养基中，24 ℃培养46 d长满瓶。将麦粒种接种到栽培料菌袋中，24 ℃培养约27 d长满菌袋。继续培养26 d至有黄色液滴产生，说明菌丝已成熟。打开袋口，去掉老菌皮，给予不低于10 ℃的温差刺激，7 d后出现米粒大小的菇蕾。菇蕾初期小米粒状，2～3 d后顶部开始膨大形成带鳞片的半球形菌盖。随着子实体的逐渐长大，菌盖展开，菌盖与菌柄接触部位的内菌幕被一层层撕裂，残留在菌盖和菌柄上形成鳞片。当菌盖刚刚完全展开时，即可采收，从现蕾到采收约10～12 d(图10)。

A，现蕾；B，现蕾3 d；C，现蕾5 d；D，现蕾8 d；E，现蕾10 d；F，现蕾12 d。

2.4 营养成分

多脂鳞伞EF-3子实体营养成分如图11所示。子实体蛋白质含量为19.94%，与大宗食用菌品种香菇、平菇、金针菇等相当；脂肪含量只有2.32%，属于高蛋白低脂肪的健康食品。多糖和游离氨基酸含量相对较低。游离氨基酸以谷氨酸含量最高，占游离氨基酸总量的31.3%。

Asp，天冬氨酸；Glu，谷氨酸；Ser，丝氨酸；Thr，苏氨酸；Ala，丙氨酸；Tyr，酪氨酸；Ile，异亮氨酸；Phe，苯丙氨酸。

3 结论与讨论

我国是食用菌生产第一大国，2019年我国食用菌总产量达到3 933.87万t[6]，其中，香菇、黑木耳、平菇等7个主要品种产量占比高达85%，说明我国食用菌产业品种结构严重不平衡，如何优化食用菌产业结构是食用菌科研人员和从业人员急需解决的问题。野生食用菌味道鲜美，营养丰富，具有一定的滋补和食疗保健价值，深受世界各地人民的喜爱，越来越多地出现在人们的餐桌上[19-20]。但是我国野生食用菌主要的获取手段是野外采集，随着人们对野生菌需求量的上升，仅靠野外采集已经不能满足需求，而过度采集不但严重影响野生食用菌的可持续发展，而且会破坏环境[21]，故开展野生食用菌的人工驯化工作势在必行[22]。

鳞伞属是球盖菇科中一个重要的属，此属的真菌除少数对人体有毒外，都是营养丰富、极具开发应用潜力的食药用真菌[23]。目前鳞伞属真菌中只有小孢鳞伞进行了大规模的人工栽培，尚有白鳞伞[24]、翘鳞伞[25]、黄鳞伞等[13]处于人工驯化阶段。

本研究采集并人工栽培了一株野生鳞伞属真菌，其子实体初期扁半球形，后期平展，黄色，具丛毛状三角形鳞片，鳞片同心圆排列；菌柄浅黄色，中生或近中生，内实，横切面水渍状斑点；菌环丝膜状，菌盖边缘残留菌幕残片，菌环以下菌柄上有淡黄色鳞片；菌肉浅黄色，菌肉与菌柄内部颜色一致；菌褶密，浅黄色，成熟后浅褐色，弯生、不等长、不分叉；担孢子肾形，顶部有孔口，孢子印褐色；菌落无色至淡黄色，菌丝多分枝，具锁状联合，产无性孢子。形态学和分子生物学鉴定确定其分类学地位为多脂鳞伞，其最适生长温度为25 ℃，最适pH值为5.0，最适碳源、氮源和无机盐分别是蔗糖、豆饼粉和MnSO4。麦粒种46 d满瓶，菌丝长满栽培袋需27 d，自接种至采收约需70 d。子实体蛋白质含量为19.94%，多糖含量为5.14%，脂肪含量为2.32%，游离氨基酸含量为2.84%。以上研究结果对野生多脂鳞伞的人工栽培具有一定的指导意义。该菌株属中低温品种，适于北方地区春秋两季大棚栽培或工厂化栽培，其示范推广有利于我国食用菌品种结构的优化。

食用菌母种培养阶段会形成粉孢子、分生孢子、节孢子、厚垣孢子等无性孢子，有的无性孢子萌发会形成不结实或结实能力差的菌丝，影响食用菌产量，如金针菇的粉孢子[26]；有的无性孢子的形成与产量和品质无直接关系，但可以缓解菌种退化，如草菇的厚垣孢子[27-28]。多脂鳞伞EF-3菌株在母种培养时也会产生大量的无性孢子，其无性孢子的类型、产生条件、萌发后菌丝的结实能力、是否会造成菌种退化等问题还需要进一步研究。