Box-Behnken设计优化小儿消积止咳制剂提取纯化工艺△

高艳红，刘金宇，曹玲，崔琳琳，关永霞*，张贵民

1.鲁南制药集团股份有限公司 中药制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂 276006；

2.鲁南厚普制药有限公司，山东 临沂 276006

小儿消积止咳制剂（口服液/颗粒）组方来源于山东中医药大学附属医院儿科名老中医毕可恩的临床经验方，由山楂、槟榔、枳实、枇杷叶、瓜蒌、连翘、莱菔子、葶苈子、蝉蜕和桔梗10 味中药制成，具有清热肃肺、消积止咳的功效[1]，临床上用于小儿饮食积滞、痰热蕴肺所致的咳嗽、喉间痰鸣、腹胀、口臭的治疗[2]，疗效显著，填补了国内治疗小儿食积咳嗽中成药的空白。文献报道其与阿奇霉素联合治疗小儿支原体肺炎亦有很好的疗效[3-5]。小儿消积止咳制剂的提取纯化工艺主要为水提醇沉[2]，本研究在多年生产数据积累的基础上，用SPSSAU 熵值法确定了各因素的权重，确定以辛弗林转移率、柚皮苷转移率和干物质得率的综合评分为考察指标，采用Box-Behnken 设计进行工艺优化[6]，最终得到了最佳提取纯化工艺。

1 材料

1.1 仪器

1260 型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；XS204 型电子分析天平（Mettler-Toledo公司）。

1.2 试药

对照品辛弗林（批号：110727-201809，纯度：99.5%）、柚皮苷（批号：110722-201815，纯度：93.4%）均购自中国食品药品检定研究院。

小儿消积止咳制剂提取液、醇沉液（中药制药共性技术国家重点实验室）；甲醇、乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 辛弗林的含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取辛弗林对照品适量，加入50%的甲醇制成质量浓度为20 μg·mL-1的溶液，即得。

2.1.3 色谱条件 色谱柱：TURNER Kromasil 100A C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-甲醇-磷酸二氢钾溶液（取磷酸二氢钾0.6 g，十二烷基磺酸钠1.0 g，冰醋酸1 mL，加水溶解并稀释至1000 mL）=15∶30∶55；流速：0.8 mL·min-1；柱温：40 ℃；检测波长：224 nm。

2.1.4 含量测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.2 柚皮苷的含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 取柚皮苷对照品适量，精密称定，加入50%甲醇制成质量浓度为60 μg·mL-1的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取提取液/醇沉液适量（折合成品0.5支/袋），至50 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（35∶65），流速：0.8 mL·min-1；柱温：40 ℃；检测波长：283 nm。

2.2.4 含量测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.3 干物质得率测定

干物质得率测定方法参考《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版（四部）通则0831“干燥失重测定法”，精密量取提取液/醇沉液10 mL，称量，记录质量，水浴蒸干，置于105 ℃烘箱，干燥至质量恒定，干燥器中冷却至室温，称质量，计算干物质得率。

秦铁崖不急不躁，依然用跳步和滑步来避开对方重拳，同时用快拳击打对方，间以龙爪手袭扰。有几次，秦铁崖的龙爪手已经扣住对方手臂，谁知没等他发力，对手故技重施，两臂往上一振，肌腱鼓荡，秦铁崖便抓握不住。

2.4 评价指标

《中国药典》2020 年版一部小儿消积止咳口服液项下的含量测定项为辛弗林，小儿消积止咳颗粒的含量测定项为柚皮苷。此外，干物质得率也是衡量工艺的重要指标。根据多年生产数据，经SPSSAU 熵值法计算确定，水提工艺综合指标（Y1）中辛弗林转移率（R1）、柚皮苷转移率（R2）、干物质得率（R3）的权重系数分别为23.15%、21.98%、54.87%，醇沉工艺综合指标（Y2）中辛弗林转移率（R4）、柚皮苷转移率（R5）、干物质转移率（R6）的权重系数分别为32.97%、38.48%、28.55%。

2.5 水提单因素试验

2.5.1 料液比对水提工艺的影响 固定提取时间为60 min，提取数为2次，考察料液比（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10）对水提效果的影响，结果见图1。由图1 可知，料液比在1∶4～1∶8 时，料液比增加，Y1随之增加，当料液为1∶8～1∶10 时，Y1趋于稳定。因此，选择料液在1∶6～1∶8进行后续Box-Behnken响应面优化水提工艺。

图1 料液比对小儿消积止咳制剂水提效果的影响（, n=4）

2.5.2 提取数对水提工艺的影响 固定提取时间为60 min，料液比为1∶8，考察提取数（1、2、3、4次）对水提效果的影响，结果见图2。由图2 可知，提取数在1～4 时，随着提取数的增加，Y1先增加后略有降低。因此，选择提取数在1～3 进行后续Box-Behnken响应面优化水提工艺。

图2 提取数对小儿消积止咳制剂水提效果的影响（, n=4）

2.5.3 提取时间对水提工艺的影响 固定料液比为1∶8，提取数为2 次，考察提取时间（30、60、90、120、150 min）对水提效果的影响，结果见图3。由图3 可知，随着提取时间的增加，Y1先增加后降低。因此，选择提取时间60～120 min 进行后续Box-Behnken响应面优化水提工艺。

图3 提取时间对小儿消积止咳制剂水提效果的影响（,n=5）

2.6 Box-Behnken响应面法优化水提工艺

2.6.1 水提方案设计及试验结果 依据Box-Behnken 响应面试验设计原理，结合上述水提单因素试验结果，进行因素水平设计与试验。因素水平见表1，设计及结果见表2～3。

表1 小儿消积止咳制剂水提工艺因素水平

表2 小儿消积止咳制剂水提工艺Box-Behnken响应面试验设计及结果

2.6.2 水提模型拟合及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行分析，得到回归方程 ：Y1=57.58+5.79A+1.31B+1.03C+0.83AB -0.52AC-0.019BC-4.32A2-1.28B2-0.82C2，r=0.923 2。结果显示，建立的回归整体模型P<0.01。失拟项P>0.01，不显著，模型成立。

A 和A22 个因素差异有统计学意义（P<0.01），B 差异有统计学意义（P<0.05）；3 个因素对Y1的交互影响分别见图4～6，可看出，A的响应面曲线陡峭且等高线密集，因此，对水提效果影响最大的因素为料液比。

图4 料液比和提取数对小儿消积止咳制剂水提工艺的影响

2.6.3 水提工艺验证 通过模型分析可以确定水提最佳工艺：料液比为1∶8，提取数为2.84 次，提取时间为99 min，此时Y1max=60.02。结合生产实际，修正最佳提取工艺：料液比为1∶8，提取数为3次，提取时间为100 min。在该工艺下重复试验3 次，Y1分别为59.58、59.63、58.73，平均值为59.31，RSD 为0.85%，接近预测值，说明优选的水提工艺稳定可行。

表3 小儿消积止咳制剂水提工艺响应面二次回归方程方差分析结果

2.7 醇沉单因素试验

2.7.1 浸膏相对密度对醇沉工艺的影响 固定醇沉时间为24 h，醇沉醇度为60%，考察醇沉前浸膏相对密度（1.10、1.15、1.20、1.25、1.30）对醇沉效果的影响，结果见图7。由图7可知，随着相对密度的提高，Y2先增加后降低。因此，选择相对密度1.15～1.25进行后续Box-Behnken响应面优化醇沉工艺。

图5 料液比和提取时间对小儿消积止咳制剂水提工艺的影响

图6 提取数和提取时间对小儿消积止咳制剂水提工艺的影响

图7 浸膏相对密度对小儿消积止咳制剂醇沉效果的影响（,n=5）

2.7.2 醇沉醇度对醇沉工艺的影响 固定醇沉前浸膏相对密度为1.23，醇沉时间为24 h，考察醇沉醇度（50%、60%、70%、80%）对醇沉效果的影响，结果见图8。由图8 可知，随着醇沉醇度的提高，Y2先增加后降低。因此，选择醇沉醇度50%～70%进行后续Box-Behnken响应面优化醇沉工艺。

2.7.3 醇沉时间对醇沉工艺的影响 固定醇沉前浸膏相对密度为1.23，醇沉醇度为60%，考察醇沉时间（12、24、36、48 h）对醇沉效果的影响，结果见图9。由图9 可知，随着醇沉时间的增加，Y2先增加后趋于稳定。因此，选择醇沉时间12～36 h进行后续Box-Behnken响应面优化醇沉工艺。

图9 醇沉时间对小儿消积止咳制剂醇沉效果的影响（,n=4）

2.8 Box-Behnken响应面法优化醇沉工艺

2.8.1 醇沉方案设计及试验结果 依据Box-Behnken 响应面试验设计原理，结合上述醇沉单因素试验结果，进行因素水平设计与试验。因素水平见表4，试验设计及结果见表5～6。

表4 小儿消积止咳制剂醇沉因素水平

表5 小儿消积止咳制剂醇沉工艺Box-Behnken响应面试验设计及结果

表6 小儿消积止咳制剂醇沉工艺响应面二次回归方程方差分析结果

2.8.2 醇沉模型拟合及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行分析，得到回归方程：Y2=74.79+5.15D-0.83E-2.74F-1.88DE-4.11DF+2.22EF -9.73D2-6.38E2-6.39F2，r=0.971 5。结果显示，建立的回归整体模型其P<0.01，达到极显著水平。失拟项P>0.01，不显著，模型成立。由结果分析可知，以Y2为响应值时，模型一次项影响顺序分别为D>F>E，其一次项D、二次项DF、D2、E2、F2差异有统计学意义（P<0.001），一次项F、二次项DE、EF 差异有统计学意义（P<0.05）；3个因素对Y2的交互影响分别见图10～12。

图10 浸膏相对密度和醇沉醇度对小儿消积止咳制剂醇沉效果的影响

2.8.3 醇沉工艺验证 通过模型分析可以确定醇沉最佳工艺：浸膏相对密度1.218，醇沉醇度58.2%，醇沉时间19.68 h，在此条件下，评价指标Y2max=76.28。结合生产实际，修正最佳醇沉工艺为浸膏相对密度1.20，醇沉醇度60%，醇沉时间20 h。在该工艺下重复试验3 次，Y2分别为76.16、75.19、75.87，平均值为75.74，RSD 为0.66%，接近预测值，说明模型可靠，优选的醇沉工艺可行。

3 结论

小儿积食是指因食物积滞于内而出现不思饮食、腹胀、腹痛、呕吐等，严重影响小儿消化吸收及生长发育。目前，临床西医治疗小儿急性支气管炎伴积食主要以抗生素控制感染及对症干预为主，可有效促进患儿症状改善及病情恢复，但尚无法完全满足临床需求[7]。近年来，中医药在儿科疾病的诊治中发挥着越来越重要的作用，中药制剂可根据小儿的生理病理特点，发挥中医整体观念、辨证论治的优势，在改善临床症状的同时减少病原体的侵袭，而且不良反应较少[8]。小儿消积止咳制剂是一种具有清热肃肺、消积止咳功效的中成药，可用于治疗小儿痰热蕴肺所致的咳嗽，在临床中常与阿奇霉素联合用于小儿支原体肺炎的治疗，并取得了良好的疗效[4]。

Box-Behnken 是一种优化多变量系统的统计方法，可通过多元二次回归方程拟合多个因素与多个响应值之间的函数关系，通过回归方程数学模型寻求最佳条件和参数，从而获得较为精确的最佳工艺参数和响应目标的最优值[9]。近年来，该方法已经被广泛应用于中药及复方有效成分的提取纯化工艺优化。

本研究采用Box-Behnken 对小儿消积止咳制剂的提取纯化工艺进行优化，使处方中各药的有效成分最大限度地溶出，并尽可能降低杂质的含量，以增加制剂的稳定性，提高临床疗效。最终优选出的提取纯化条件为料液比1∶8，提取数为3 次，提取时间为100 min，醇沉浸膏相对密度1.20，醇沉醇度60%，醇沉时间20 h。经验证，应用Box-Behnken设计所得的小儿消积止咳制剂纯化工艺稳定可行、重现性良好，为后续药物制剂及临床药效的发挥提供参考。

图11 浸膏相对密度和醇沉时间对小儿消积止咳制剂醇沉效果的影响

图12 醇沉醇度和醇沉时间对小儿消积止咳制剂醇沉效果的影响