云南烟草抗感PVY品种上Potyvirus属病毒种类调查

于海芹，黄昌军，袁 诚，曾建敏，刘 勇

(云南省烟草农业科学研究院/烟草行业烟草生物技术育种重点实验室/国家烟草基因工程研究中心，云南 昆明 650021)

【研究意义】烟草病毒病是目前烟叶生产上危害重、分布广的一大类病害，严重影响烟叶的质量和产量，造成的经济损失已经远远超过细菌类和真菌类病害[1-2]。据报道，世界烟草病毒种类达47种，目前中国已经鉴定的烟草病毒病有近20种[1-4]，其中田间危害较为严重的病毒种类主要有烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)[2,5-13]，2001年和2002年从云南省11个县采集的520个烟草样本中，TMV、CMV和PVY总检出率分别为71.74%、55.01%和6.35%[14]。而烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus,TEV)、烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV)和红辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)在部分烟区也造成一定危害[9,13-15]。其中，Potyvirus属病毒PVY、TEV、TVBMV、ChiVMV在云南省烟草作物上都有报道，Potyvirus属病毒田间主要以蚜虫非持久方式传播，也可以通过摩擦传播[3]，在烟草上引起花叶、脉带、蚀纹和叶脉坏死等症状，这4种Potyvirus属病毒症状的相似性较高，简称为Potyvirus典型症状。【前人研究进展】种植抗病品种是防治病害经济有效的措施。云南省烤烟主栽品种为云烟87、K326和红花大金元等，均感PVY、TVBMV和ChiVMV[16-18]。中国目前无抗TVBMV和ChiVMV烤烟品种，国内外抗PVY烤烟品种大多数携带va位点(简称va品种)。已被育种利用的va位点主要来源于X-射线诱变获得的突变体，缺失eIF41-S基因所在的染色体片段。感病品种携带PVY侵染烟草所利用的eIF4E-S基因(简称Va品种)。从美国引进的抗PVY烤烟品种NC102、NC55，由于生态适用性等原因，在云南省种植面积较小。直到2015年云南省才自育出抗PVY新品种(系)，有云烟301(抗PVY云烟87)、云烟121、YATAS-6等，其中云烟301是利用va位点定向改良主栽品种云烟87的PVY抗性选育而成，在改良抗性时保留云烟87优良的栽培烘烤特性、原烟外观性状和感官性状，示范推广前景广阔。这些自育抗PVY烤烟品种(系)2017年开始在PVY危害较重的田块小面积种植。【本研究切入点】2017—2019年在云南省主要烟区进行调查、取样和鉴定，分析抗/感PVY主栽品种(系)上Potyvirus属病毒的种类。【拟解决的关键问题】明确当前Potyvirus属病毒在云南省烟草作物上的分布情况、va品种示范推广可能遇到的病原压力，为云南省烟草va品种布局和病毒病防控等提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2017—2019年，烟草现蕾期至第2次采烤期间，在昆明市石林县、宜良县，曲靖市富源县、罗平县、麒麟区、师宗县，玉溪市澄江县、峨山县、易门县、元江县，昭通市昭阳区，普洱市镇沅县、景东县，5个市共13个植烟县(区)，共采集497个表现花叶、脉带、蚀纹和叶脉坏死等Potyvirus属病毒典型症状的烟草样品，不包含烟草花叶病毒和番茄斑萎病毒典型症状样本。新鲜样本检测或-80 ℃冻存后检测。

1.2 ELISA检测方法

样品准备：取6 个叶圆片于2 mL 离心管中，加钢珠在磨样仪上研磨，加入1 mL 磨样缓冲液于离心管中摇匀，5000 r/min 离心10 min备用。结果判断：(样品OD405值/阴性对照OD值)>1.5判断为阳性；(样品OD405值/阴性对照OD值)<1.5判断为阴性。

PotyvirusGroup 抗原直接包被法检测试剂盒为Agdia公司产品(www.agdia.com)，该检测试剂盒可同时检测Potyvirus属病毒。PVY和TEV双抗体夹心法检测试剂盒为Agdia公司产品(www.agdia.com)。TVBMV和ChiVMV的双抗体夹心法检测试剂盒为Nano Diagnostics LLC公司产品(www.nanodiagnostics.com)。试剂盒检测方法参考试剂说明书。

抗原直接包被法步骤如下：CB缓冲液作为磨样缓冲液，磨样后每孔加120 μL，避光室温(21～24 ℃)反应1 h；用PBST洗板4次；PBST稀释的5%脱脂奶粉每孔加120 μL，避光室温反应1 h；用PBST洗板4次；ECI缓冲液稀释的一抗每孔加100 μL，避光室温反应2 h；用PBST洗板4次；ECI缓冲液稀释的AP酶标抗体每孔加100 μL，避光室温反应1 h；用PBST洗板4次；10 mL 1×PNP缓冲液中加入0.01 g PNPP-Na，每孔加入100 μL，避光室温反应，30和50 min分别测定OD405值。

双抗体夹心法步骤如下：CB缓冲液稀释包被抗体每孔加120 μL，避光4 ℃过夜或室温(21～24 ℃)反应4 h；用PBST洗板4次；样品缓冲液磨样的样品每孔加100 μL，避光室温反应1 h；用PBST洗板4次；试剂盒推荐的缓冲液稀释AP酶标抗体每孔加100 μL，避光室温反应1 h；用PBST洗板4次；10 mL PNP缓冲液中加入0.01 g PNPP-Na，每孔加入100 μL，避光室温反应，第30和60分钟分别测定OD405值。

2 结果与分析

2.1 云南省烟草主要病毒种类及其发生频率

为了解云南省烟草Potyvirus属病毒种类分布，2017—2019年，在5个市的13个植烟县(区)，共采集表现花叶、脉带、蚀纹和叶脉坏死等Potyvirus属病毒典型症状的烟草样品497个。从抗PVY品种采集的样品数量为8～108个，从感PVY品种采集的样品数量为3～89个。每个样品首先采用ELISA检测Poty，Poty阳性样品再采用ELISA检测PVY、TVBMV、ChiVMV和TEV。497个样品中Potyviruses检出率85.1%，PVY、TVBMV、ChiVMV和TEV的检出率分别为14.9%、58.8%、23.3%和7.8%，其它未鉴定到种的Potyviruses样品(Poty阳性而4种病毒ELISA检测阴性的样品)占3.4%(表1)。云南烟草Potyvirus属病毒检出率从高至低分别为TVBMV、ChiVMV、PVY和TEV。因为种植抗PVY品种会导致Potyvirus属病毒检出率变化，所以笔者根据感PVY品种的检出率分析各市Potyvirus属病毒的种类及其比例。各地感PVY品种检出率从高至低排列顺序，玉溪市为ChiVMV、TVBMV、TEV、PVY，曲靖市为TVBMV、PVY和TEV、ChiVMV，昭通市为PVY、TVBMV、TEV、ChiVMV，昆明市和普洱市的样品数量较少，未进行排序。可见不同地区Potyvirus属病毒的检出率存在较大差异。其中TVMBV的发生危害较为普遍，其检出率在玉溪、曲靖和昭通样品中均排在第1位或第2位。玉溪样品ChiVMV检出率最高，昭通样品PVY检出率最高，与昭通近年来烟草PVY的危害较为突出的现象相符。

2.2 抗/感PVY品种Potyvirus属病毒检出率分析

为了解云南省烟草抗/感PVY品种Potyvirus属病毒种类差异分布，按照抗/感PVY品种分类统计(表2)，感PVY品种上PVY、TVBMV、ChiVMV、TEV的检出率分别为22.5%、41.7%、25.8%、11.4%，Potyvirus属其他病毒的检出率为4.8%。抗PVY品种上PVY、TVBMV、ChiVMV、TEV的检出率分别为5.8%、79.2%、20.4%、3.5%，Potyvirus属其他病毒的检出率为1.8%。对比抗/感PVY品种Potyvirus属病毒检出率差异，抗PVY品种比感PVY品种的PVY检出率低16.7%，下降的PVY发病率相当于抗PVY品种的防治效果。表明抗PVY品种能有效控制PVY的危害。抗PVY品种比感PVY品种的TVBMV检出率高37.5%，抗PVY品种的ChiVMV检出率无明显上升(比感PVY品种的检出率低5.4%)。值得注意的是，TVBMV检出率升高，并不能说明抗PVY品种更感TVBMV，而是由于PVY发病率减少导致的。昭阳区相距20 km的北闸和守望2个乡(镇)，同一天采集的样品检测结果支持该结论(表3)，在北闸抗PVY品种上采集的样品中，PVY和TVBMV的检出率分别为3.4%和95.4%；在守望感PVY品种上采集的样品中，PVY和TVBMV的检出率分别为50.0%和25.0%；在抗PVY品种Potyvirus属病毒发病率低于感PVY品种的情况下，在抗/感病品种上分别采集相同数量的Potyvirus属病毒的典型症状样品，由于PVY样品比例降低导致抗PVY品种的Potyvirus属其他病毒检出率升高。

表1 云南省烟草Potyvirus属病毒种类及其检出率

表2 抗/感PVY烟草品种Potyvirus属病毒的种类及其检出率

表3 PVY重病区抗/感PVY品种Potyvirus属病毒种类及其检出率(昭阳区)

为验证抗PVY品种不会导致TVBMV和ChiVMV的危害上升，而是采样方法和PVY发病率差异导致的，选择在PVY发病率低的玉溪澄江品种园采样检测。该品种园为了展示抗/感PVY品种的植物学和农艺性状，在一个0.67 hm2连片的地块，相邻种植了抗PVY品种(云烟301，云烟121)和感PVY品种(云烟87，K326)，而且该地块打顶后PVY、TMV和TSWV等病毒病发生率不超过1%，不会干扰Potyvirus属病毒的采样和检测。为了使采集样品能代表真实的发病情况，减少采样方法对检出率的影响，每个品种均匀挑选8～10行(每行40～50株)，每行逐株调查，挑选典型Potyvirus属病毒症状采样。在2个抗PVY品种中采集的74个样品中，Potyvirus属病毒检出率达到97.3%，在2个感PVY品种中采集的45个样品中，Potyvirus属病毒检出率达到93.3%，PVY检出率分别为0和2.2%(表4)。表明抗/感PVY品种上的Potyvirus属病毒检出率很高，且相互之间无明显差异，可排除PVY、TMV、TSWV等病毒的干扰。抗/感PVY品种上TVBMV的检出率都是91.0%以上，抗/感PVY品种上ChiVMV的检出率分别为58.1%和91.1%。表明澄江品种园抗PVY品种无TVBMV和ChiVMV的检出率升高现象，即种植抗PVY品种不会导致同属的TVBMV和ChiVMV危害上升。

表4 PVY轻病区抗/感PVY品种Potyvirus属病毒种类和检出率(澄江品种园)

3 讨 论

3.1 云南烟草Potyvirus属病毒种类及其比例

云南省5个市13个县采集的497个样品中Potyvirus检出率81.58%，PVY、TVBMV、ChiVMV和TEV的检出率分别为14.9%、58.8%、23.3%和7.8%，其他未鉴定到种的Potyviruses样品占3.4%。烟草上Potyvirus属病毒受地域、前作和耕作制度的影响较大，相邻田块病毒分布也不均匀，年度间存在较大波动。为准确掌握不同病毒分布，需要多年多点随机采样检测。

PVY发病率高的地区，多是马铃薯的种植年限长，与玉米套种，玉米/马铃薯与烟草轮作或者邻近种植，地块被杂草包围(部分杂草是PVY的寄主)。因耕作制度造成的烟草PVY危害区域相对固定，危害较为严重，可通过种植抗PVY的va品种来降低损失，如云烟301(抗PVY云烟87)和云烟121等。

由于TVBMV和ChiVMV的田间症状不明显，在打顶前后才达到发病高峰，此时间段的基层技术人员和烟农忙于采烤和收购，因此，TVBMV和ChiVMV的发生和危害较少被关注，在云南烤烟上造成的危害被较大低估。目前我国烤烟主栽品种都感TVBMV和ChiVMV，且世界上少见开展TVBMV和ChiVMV抗病种质资源鉴定和筛选，更加缺乏抗病烤烟品种，因此有必要开展抗TVBMV和ChiVMV的种质资源鉴定、发掘和创制。

3.2 种植抗PVY品种对TVBMV和ChiVMV危害的影响

在不考虑发病率高低、采样方法等的情况下，仅根据总样品中病毒种类的检出率，容易观察到抗PVY品种上TVBMV和ChiVMV检出率升高的现象，进而得出一个模糊的结论“抗PVY品种易感其他病毒病”。本研究分析表明：种植抗PVY品种不会导致TVBMV和ChiVMV危害上升。在PVY发病率低于1%的澄江品种园，抗PVY品种与感PVY品种的TVBMV或ChiVMV的检出率相当或降低(表4)。在PVY重病地块(昭阳区)，抗PVY品种上TVBMV或ChiVMV的检出率高(表3)，是由于在抗感PVY品种上采集相同数量的该属病毒典型症状样品检测导致的。PVY重病地块种植抗PVY品种，PVY发病率下降、Potyvirus属病毒的总发病率下降，但会导致有症状样品TVBMV或ChiVMV的检出率升高。

3.3 品种布局的指导

烤烟感染PVY、TVBMV和ChiVMV后，田间症状难以区分。因此，在Potyvirus属病毒危害较重田块，有必要先通过室内鉴定确定病原种类，将va品种种植在PVY为主的区域。在种植va品种的田块，如果在烟株打顶前后发现Potyvirus属病毒发病率较高，需要采样进行病原种类鉴定，明确是由TVBMV或ChiVMV引起，还是由PVY病毒变异克服了va抗性引起的。云南烟区刚刚开始推广va品种，病毒变异克服va抗性的概率较小。田间抗PVY品种表现花叶、脉带症状，大部分是感染TVBMV和ChiVMV，而不是基层人员所怀疑的PVY抗性被克服。本研究214个抗PVY品种样品检出PVY的比例仅占5.8%。法国和巴西长期种植va品种，虽然突破va抗性的PVY危害上升，大面积种植10年或30年仍然能有效降低PVY损失。

3.4 烤烟中后期病毒病危害

大田期烤烟病毒病种类存在此消彼长的现象。团棵期和旺长期以TMV和TSWV为主，这2种病害的症状较为独特，田间相对容易诊断。Potyvirus属病毒主要出现在现蕾期至第1～2次采烤期(打顶前后1个月)，这个阶段前期感染的TMV开始隐症，TSWV病株大部分已经死亡，PVY病叶主叶脉坏死，而TVBMV和ChiVMV的症状不如PVY明显。本研究发现，云南主要烟区TVBMV和ChiVMV的发病率高，造成的产量和品质损失有待评估。

普查烟草上病害种类的分布和频率时，应记载品种的抗性，分析品种抗性对病害种类分布和频率的影响。在分析某种病害的检出率高低时，应分析该种病害的发病率高低和采样方法对检出率的影响。采样方法越能代表病害的发病率，得出的检出率数据越准确。首先，根据基层人员历年和当年掌握的情况，确定目标病害发病率较高且其他非目标病害较低的田块；然后，随机挑选能代表该田块的几行，每行逐株调查采样。为了排除非目标病害对目标病害的干扰，在抗非目标病害品种上调查目标病害的发生和病原种类，是一种较好的选择。比如，在抗TMV的NC102上调查Potyvirus属病毒；在抗PVY品种上调查TVBMV和ChiVMV，前提条件是目标病害与非目标病害之间不存在拮抗或协同关系。

4 结 论

昭阳区和澄江品种园的样品检测结果均证明，抗PVY品种的TVBMV检出率升高，是由PVY发病率降低导致的，抗PVY品种不会导致TVBMV和ChiVMV危害上升。PVY高发病区可通过种植抗PVY品种来降低损失，种植前宜进行病原种类鉴定，以便将va品种布局在PVY为主的区域。云南主要烟区TVBMV和ChiVMV的发病率高，缺乏抗病品种，需开展抗TVBMV和ChiVMV的种质资源鉴定、发掘和创制。