GC×GC- TOF MS分析中国劲酒基酒挥发性成分

景 思， 宋学博， 朱 琳， 郑福平,*， 黄明泉， 吴继红，杨 强， 童国强

(1.北京工商大学 食品质量与安全北京实验室/中国轻工业酿酒分子工程重点实验室， 北京 100048；2.劲牌有限公司， 湖北 大冶 435100)

保健酒是以白酒或其他酒类为基酒，佐以中药材，对人体具有保健功效的酒饮料。保健酒由具有上千年历史的中国传统药酒延伸而来，作为保健食品，属于《保健食品管理办法》的管理范畴。中国劲酒是保健酒的代表产品之一，通常以清香型小曲酒为基酒，加入淮山药、仙茅、当归、肉苁蓉、枸杞子、黄芪、淫羊藿等药材经过现代提取与分离技术调配制成。目前已有对保健酒挥发性成分分析的文献报道。刘源才等[1]采用气相色谱- 质谱联用法(GC- MS)对中国劲酒的化学组分进行分离鉴定，共定性出30种化合物，其中主要识别成分及部分功能性微量成分为：乙酸龙脑酯、丁香酚及其异构体、十八碳二烯酸以及二十二碳六烯酸(DHA)。刘胜华等[2]采用蒸馏浓缩、液- 液萃取及固相微萃取3种前处理方法结合GC- MS对中国劲酒中挥发性物质进行检测，共定性出103种成分,其中酯类25种、醇类19种、烯萜类18种、酚醛类19种、酸类9种、其他烃类13种，其中乙酸龙脑酯、藁本内酯、1-戊醇、桂皮醛、柠檬烯、丁香油酚、樟脑含量较高。基酒作为中国劲酒的重要组成部分，其挥发性成分对中国劲酒整体的风味起到重要作用。目前尚无对中国劲酒基酒挥发性成分研究的报道。

目前，气相色谱- 质谱联用仪是主要的饮料酒挥发性成分研究手段[1-3]。但是，酒是一种复杂的发酵产物，截至2015年，白酒中有1 737种化合物被报道[4]，因此仅借助于GC- MS难以满足对复杂成分的研究。全二维气相色谱- 飞行时间色谱联用仪(comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry, GC×GC- TOF MS)因高分辨率、高灵敏度、高峰容量等优点在酒挥发性成分分析中被广泛应用。该技术通过一个调制器串联2种分离机理不同的毛细管色谱柱形成二维气相色谱系统[5-6]，结合标准品保留时间和NIST谱库定性，可高效分离鉴定多种挥发性微量成分。季克良等[7]采用液- 液萃取法(liquid-liquid extraction, LLE)结合GC×GC- TOF MS对我国3大香型白酒进行微量成分分析，结果表明：GC×GC- TOF MS在白酒微量成分分析及白酒风格形成机理研究领域优势明显。Li等[8]运用GC×GC- TOF MS技术对国井芝麻香型白酒进行定性分析，共定性出509种挥发性化合物，并在白酒中首次发现了苯甲硫醇，并确定其与己酸乙酯、辛酸乙酯和二甲基三硫为国井芝麻香型白酒的重要香气化合物。Yao等[9]利用GC×GC- TOF MS技术在18种泸州老窖酒中共定性出1 300种化合物，其中320种化合物为18种酒样中共有化合物。

本研究采用LLE结合GC×GC- TOF MS对2种中国劲酒基酒的挥发性化合物进行分析，对挥发性化合物的种类和含量，以及其中的醇类化合物、酯类化合物、醛酮类化合物、缩醛类化合物、酸类化合物、呋喃类化合物、酚类化合物、内酯类化合物、含氮化合物、含硫化合物和酸酐类化合物进行分析，希望为中国劲酒的重要风味物质研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2种小曲清香型中国劲酒基酒样品编号为J1和J2，酒精度分别为46%和41%，于2017年5月酿造，2018年3月取得样品，为中国劲酒泡药前的基酒，由劲牌有限公司提供。

正丙醇、丙烯醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、2-甲基烯丙醇、2-甲基-1-丁醇、正戊醇、异戊醇、正己醇、环己醇、1,2-丙二醇、糠醇、苯乙醇、乙酸丁酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、丁酸丙酯、异戊酸乙酯、己酸乙酯、己酸丙酯、己酸丁酯、癸酸乙酯标准品，色谱纯，北京伊诺凯科技有限公司。2-庚酮、巴豆醛、壬醛、糠醛、苯乙醛、丙酸、正丁酸、正戊酸、正己酸、癸酸、苯甲酸、4-甲基苯酚、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、苯并噻唑标准品，色谱纯，半夏试剂公司。氯化钠、无水硫酸钠、二氯甲烷，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

GC×GC- TOF MS系统包括Agilent 7890B型气相色谱仪[第一维柱DB- WAX (30 m×0.25 mm×0.25 μm)、第二维柱DB- 5 (2 m×0.1 mm×0.1 μm)，两根色谱柱以串联方式连接]，美国Agilent公司；Pegasus 4D型飞行时间质谱仪，美国LECO公司；ASONE型电子分析天平，中科科仪有限公司；RE- 52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；N- EVAPTM型氮吹仪，美国Organomation Associates公司；VORTEX2型涡旋仪，德国IKA公司；10、100、200、1 000 μL移液器，国药集团化学试剂有限公司；10 mL容量瓶、2 mL进样瓶，中科科仪有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1样品前处理方法

采用LLE方法对中国劲酒基酒样品进行前处理。取中国劲酒基酒样品25 mL，用煮沸冷却至室温的超纯水稀释至酒精度为10%，加入氯化钠至过饱和，用重蒸的二氯甲烷萃取3次，每次50 mL，合并3次萃取的有机相，加入无水硫酸钠除水，置于-20 ℃冰箱中过夜，过0.22 μm滤膜后旋蒸浓缩氮吹至约0.5 mL，每次进样1 μL，用于GC×GC- TOF MS分析[10]。

1.3.2分析方法

色谱- 质谱分析条件是根据仪器的要求和对实验样品的预实验测试得出的。GC×GC- TOF MS仪需要两个不同极性的色谱柱，本研究选择了常用的极性DB- WAX和非极性DB- 5，二者结合能将极性和非极性的化合物较好的分离。调制时间选择为5 s是预实验使用的GC×GC- TOF MS仪较好的调制周期，该调制时间下分离效果较好。

1.3.2.1 色谱分析条件

GC×GC气相色谱的载气为He，纯度99.999%，流速1 mL/min。进样口温度250 ℃，压力30 psi(206.84 kPa)，分流比为10∶1。主柱温箱升温程序：初始温度50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升至150 ℃，以5 ℃/min升至230 ℃，保持10 min。第二柱温箱升温程序同主柱温箱，并且始终高于主柱温箱5 ℃。调制器温度始终高于主柱温箱15 ℃。调制周期5 s；冷吹时间1 s。

1.3.2.2 质谱分析条件

电子轰击(EI)离子源；电子能量70 eV。飞行时间质谱的离子源温度250 ℃，传输线温度250 ℃。溶剂延迟时间200～300 s，扫描区间m/z45～350。

1.3.2.3 定性和定量方法

采用GC×GC- TOF MS自带的LECO Chroma TOF version 4D软件进行数据处理，用NIST 2014谱库检索，选取匹配度在700以上的化合物，剔除柱流失物质；在相同的GC×GC- TOF MS条件下进样40种化合物标准品，通过与未知物的保留时间和质谱图对比进行标准品对比定性。

采用相对峰面积法对化合物进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 2种中国劲酒基酒的挥发性成分检测结果

采用LLE法提取2种中国劲酒基酒挥发性成分进行GC×GC- TOF MS分析得到的三维总离子流见图1。经过质谱解析、标准品对比的定性方法在GC×GC- TOF MS检测的2种中国劲酒基酒中定性出的挥发性化合物见表1。

图1 中国劲酒基酒的挥发性成分三维总离子流图

表1 中国劲酒基酒挥发性成分分析结果

续表1

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2.2 2种中国劲酒基酒的挥发性成分分析

2.2.1挥发性成分种类与含量分析

LLE结合GC×GC- TOF MS对2种中国劲酒基酒中的挥发性成分进行分析，共定性鉴定出化合物175种，采用标准品定性化合物40种，其中醇类化合物41种、酯类化合物53种、醛酮类化合物25种、缩醛类化合物2种、酸类化合物24种、呋喃类化合物8种、酚类化合物3种、内酯化合物8种、含氮化合物8种、含硫化合物1种和酸酐类化合物2种。2种样品酒的挥发性成分定性结果显示，J1样品酒中检出挥发性化合物种类为151种，J2样品酒中检测出挥发性化合物132种，共同检测出挥发性出化合物108种。

2.2.2醇类化合物分析

酒中醇类化合物含量最多的是分子结构较为简单的乙醇，乙醇和水作为主体占白酒体系的98%，有研究表明：乙醇的存在对气味感官也具有重要意义[11]。J1样品酒和J2样品酒中分别检测到37和29种醇类化合物。在2种样品酒中共同检测出25种醇类化合物，其中正丙醇、正丁醇、仲丁醇、异丁醇、异戊醇、正己醇、苯乙醇含量较高。异戊醇是白酒中重要的醇类化合物，呈杂醇油、酒精、香蕉样香气，在J1和J2样品酒中含量差别不大。正戊醇呈现青草和水果香气，在2种酒样中均被检出，虽然在本研究中所得占比并不大，但该化合物在中国劲酒风味中具有重要贡献[3]。正丙醇和正丁醇在醇类中占比相对较大，经研究证明是中国劲酒中重要挥发性成分[2]。正壬醇呈现花香和类脂肪臭气味，仅在J2样品酒中检测到该化合物。异丁醇具有杂醇油气味，在2种样品酒中都存在，且相对含量较高。1-辛烯-3-醇呈现类似蘑菇的香气，在J1和J2样品酒中被检出。丙烯醇是一种不饱和醇类，2种样品酒中都检测出该化合物，该化合物具有催泪作用，有研究推测该化合物的出现是因为大曲或者酒醅感染杂菌所致。2种样品酒中都检测出2,3-丁二醇，该化合物主要呈现黄油和奶油香气，是白酒中极少数的有香气贡献的多元醇。此外，丙烯醇、正己醇、糠醇和苄醇都曾在中国劲酒中被测出[2-3]。

2.2.3酯类化合物分析

2种白酒样品中酯类化合物的数量最多，J1样品酒中共检测出酯类化合物45种，J2样品酒中共检测出酯类化合物41种。2种样品酒中共有的酯类化合物为33种，相对含量较高的为：丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、2-羟基丁酸乙酯、辛酸乙酯、乳酸丁酯、丁二酸二乙酯和苯乙酸乙酯，可认为在中国劲酒整体风味中起重要作用。无论在发酵还是老熟阶段，酯类化合物主要通过醇和酸的酯化反应产生[12]。酯类化合物是白酒中重要的芳香化合物，其中乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯为白酒中的四大酯，乙酯类化合物常呈现水果及花香，赋予白酒怡人的香气，在白酒中广泛存在[13-15]。乙酸乙酯呈酒香和果香，只在J2样品酒中测得。丁酸乙酯在J1和J2样品酒中均测得，其相对峰面积分别为0.54%和0.18%，在各自样品中分别占有较大比重，呈菠萝、玫瑰样香气。乳酸乙酯在2种样品酒中均被测得，其相对峰面积分别为0.22%和0.031%，呈果香，且被认为是中国劲酒重要挥发性成分之一[2]。己酸乙酯在2种酒样中的相对峰面积分别为2.3%、0.47%，差别较大，呈现菠萝、香蕉香气。己酸乙酯也是浓香型白酒的特征香气化合物[16]。4种酯类化合物在2种样品酒中所占比重不同，导致酒样之间风味产生差异。此外，乙酰丙酸乙酯呈花香、果香及菠萝样香气；丁二酸二乙酯呈水果及苹果样香气；丁二酸单乙酯呈花香及果香，三者分别在先前的研究中被测得[2-3]。

2.2.4醛酮类化合物分析

J1和J2样品酒中分别检出醛酮类化合物24种和17种，16种醛、酮类化合物在2种样品酒中均被检测到，其中相对含量较高的为：三聚乙醛、2-庚酮、2-壬酮、糠醛、3-羟基丁醛和苯乙醛。糠醛也是呋喃类化合物，广泛存在于各种食品中，具有甜香、焦香和坚果香。2种样品酒中均检测到呈果香和青香的己醛。J1和J2样品酒中检测到壬醛，但是从相对峰面积来看，壬醛占比重很小，具有强烈的脂肪臭和果香。丙烯醛在J1和J2样品中检出，在高浓度时具有恶臭气味。2-戊酮仅在J1样品中被检出，2-庚酮和2-壬酮在J1和J2样品被检出，以上3种酮类化合物具有花香、果香和柑橘香气。J1和J2样品酒中检测苯乙酮(乙酰苯)，呈甜香。2种样品酒中检测出的环酮类化合物有环戊酮、环己酮。

2.2.5缩醛类化合物分析

醇和醛在过量醇的存在下形成缩醛[17]。在中国劲酒基酒中只检测到异丁醛二乙缩醛和2,2-二乙氧基乙醇两种缩醛类化合物，且在两种样品酒中均被检出；异丁醛二乙缩醛具有水果香气。

2.2.6酸类化合物分析

2种样品酒中共同检测出13种酸类化合物，其中乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸、正己酸、庚酸和正辛酸含量较高。J1和J2样品酒中都分别测得酸类化合物19种。乙酸又称醋酸，在2种样品酒中均检测到该化合物，是白酒中重要的香气物质，也是中国劲酒中重要挥发性化合物[2]。丙酸具有明显的酸味，随着碳数的增加酸类物质的酸味降低。正丁酸(酪酸)具有一定的奶酪香气，且在2种样品酒中的含量都相对较高，相对峰面积在0.26%～3.4%，是中国劲酒中重要香气成分[3]。正戊酸和正己酸与正丁酸相似，具有奶酪的香气，2种样品酒中都检测到这2种化合物。2种样品酒中都检测到癸酸，该化合物具有脂肪臭等不愉快气味。月桂酸(十二烷酸)仅在J1样品酒中被检测到，但是该酸气味较弱，对酒的风味贡献微乎其微。棕榈酸(十六烷酸)和月桂酸的气味特性类似，存在于J2样品酒中，推断其在样品酒中几乎起不到风味贡献作用，但是棕榈酸与白酒的冷浑浊相关。异丁酸(2-甲基丙酸)、异戊酸(3-甲基丁酸)和异己酸(4-甲基戊酸)同属于支链酸，2种样品酒中都检测到这3种化合物，且这3种化合物都具有轻微的腐臭和汗臭。乳酸仅在J2样品酒中检测到，该化合物是一种挥发性极弱的脂肪酸，在白酒中含量极高，虽然它的香气贡献小，但是它是一种良好的酸味剂。J1样品酒中检测到巴豆酸(E-2-丁烯酸)，它是一种不饱和脂肪酸，具有强烈的尖酸气味。苯甲酸(安息酸)呈水果香，在J1样品酒中检测出该化合物。

2.2.7呋喃类化合物分析

2种样品酒中共同检测出5种呋喃类化合物，分别是：2-乙酰基呋喃、5-甲基呋喃醛、5-甲基-2-乙酰基呋喃、3-甲基-2-(5H)-呋喃酮和2-丙酰呋喃。通过高温下糖的非酶促褐变促进呋喃形成[18]。2-乙酰基呋喃呈焦糖和甜香，对咖啡和土豆的风味起到重要作用。5-甲基-2-乙酰基呋喃具有强类甜香、坚果、霉香和焦糖样香气，有干草、香豆素的香韵。2-丙酰呋喃具有轻微的水果香气。

2.2.8酚类化合物分析

样品J1和J2中共同定性3种酚类化合物，分别是：苯酚、4-甲基苯酚和3-乙基苯酚。通过分析3种酚类化合物的相对峰面积可知，酚类化合物在白酒中的含量非常少。苯酚是最简单的酚类化合物，4-甲基苯酚又称为对甲苯酚，呈现烟熏和皮革气味。目前红酒中对酚类化合物的研究较多，酚类抗氧化性能强，因此在中国保健白酒中可以进一步发挥该类化合物的健康功效[19]。

2.2.9内酯类化合物分析

2种样品酒中共同检测出6种内酯类化合物，分别是：γ-丁内酯、甲基-γ-丁内酯、γ-戊内酯、γ-己内酯、α-丙基-γ-庚内酯和δ-己内酯。γ-内酯是含有五个碳环的含氧化合物，γ-丁内酯和γ-己内酯具有椰香和焦糖香气。γ-戊内酯具有棉花糖香气和烤面包的香气。当归内酯仅存在于J2样品酒中，它是中药当归的重要成分，是一种对人体有益的健康成分。

2.2.10含氮化合物分析

在2种样品酒中共同检测出6种含氮类化合物，也是第一次在中国劲酒中检测到吡嗪类化合物，分别为：2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪，其质谱信息见图2。吡嗪类化合物都含有1,4-二氮基团，且都具有较低阈值，主要通过糖和氨基之间的美拉德反应形成[20]。2-甲基吡嗪具有烘焙香和可可香，2,3-二甲基吡嗪具有烤肉香，2,5-二甲基吡嗪具有烤肉香和巧克力香气，2,6-二甲基吡嗪具有咖啡和焙烤香气，2,3-二甲基-5-乙基吡嗪具有焙烤和可可香气，2,3,5-三甲基吡嗪具有焦糊气味。2,3,5,6-四甲基吡嗪，又名川芎嗪，是中药川芎的主要有效成分，具有抗氧化，增强免疫等功效[21-22]。

图2 中国劲酒基酒中6种含氮和1种含硫化合物的质谱

2.2.11含硫化合物分析

2种酒中检测到的含硫化合物较少，只有J1样品酒中检测到苯并噻唑，噻唑类化合物同时含有硫元素和氮元素，在白酒中广泛存在，具有烟熏味和橡胶样气味[23-24]，与Zhu等[25]所得结果吻合。苯并噻唑在中国劲酒中首次发现，其在样品中的质谱图见图2(g)。含硫化合物具有含量少、阈值低的特点，在食品中具有重要贡献[26-27]。由于2种酒样中含硫化合物含量可能较低，GC×GC- TOF MS不能对其进行很好的检测，因此在下一步工作中将使用专用型仪器全二维气相色谱- 硫化学发光检测器联用仪(GC×GC- SCD)对含硫化合物进行分析。

2.2.12酸酐类化合物分析

仅在J2样品酒中检测到酸酐类化合物，分别为丙酸酐和己酸酐，且相对含量较低。

3 结 论

本研究采用LLE结合GC×GC- TOF MS对2种中国劲酒基酒中的挥发性成分进行分析，共定性出175种化合物，其中醇类化合物41种、酯类化合物53种、醛酮类化合物24种、缩醛类化合物2种、酸类化合物25种、呋喃类化合物8种、酚类化合物3种、内酯化合物8种、含氮化合物8种、含硫化合物1种和酸酐类化合物2种。40种化合物通过标准品准确定性。2种基酒的挥发性成分定性结果显示，J1、J2样品酒中检出的化合物种类分别为151种、132种，共同检测出化合物108种。其中，2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和2,3-二甲基-5-乙基吡嗪和苯并噻唑在中国劲酒中为首次发现。通过液- 液萃取结合GC×GC- TOF MS技术可快速、准确分析鉴定出中国劲酒基酒中挥发性成分，希望本研究结果可为中国劲酒的重要风味物质研究提供参考。