不同发酵条件对欧李酒多酚含量及苦味的影响

李姝琪，郭晓梦，张惠玲*

宁夏回族自治区宁夏大学食品与葡萄酒学院宁夏食品微生物应用技术与安全控制重点实验室（银川 750021）

欧李为蔷薇科樱属的灌木，是中国独有的果树品种[1]。欧李果实中富含多酚物质及多种糖酸[2]、维生素等营养物质，具有显著的保健功能[3]。欧李果酒是指以欧李果实为原料，经过发酵酿造而得的果酒，其酒体呈宝石红，酒香浓郁，酒体醇厚，余味绵长，含有多种营养物质[4]。欧李酒中的多酚物质是欧李酒中的重要组成成分，是欧李酒中的主要风味物质，对酒的品质起着重要作用[5]，多酚物质的浓度超过其阈值时，酒就会产生其特有的苦涩味。儿茶素、表儿茶素、诺米林等多酚物质主要赋予欧李酒的苦味，单宁对苦涩味也有贡献，但浓度都不能太高，不然会使酒的苦涩味变重，影响酒的风味和口感[6]。

现阶段，欧李主要用于制作果干、果脯和果汁等食品，研发产品过于单调，应用范围窄。随着欧李果酒产业的发展，人们对欧李果酒的酿造工艺研究较多，但是对不同发酵条件影响多酚物质含量以及对欧李酒苦涩味的影响，报道很少。试验对欧李品种4号进行酿造，通过测定不同发酵条件下欧李酒中多酚含量，了解不同发酵条件对欧李酒多酚含量以及苦味的影响，选出最优发酵条件，为欧李酒发酵工艺的改进和低苦欧李酒的研发提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

农大欧李4号，来自宁夏中卫；酿酒活性干酵母Excellence XR，法国Lamothe-Abiet公司。甲醇、原儿茶酸、儿茶素、咖啡酸、柠檬苦素、柚皮素、诺米林、绿原酸，均为色谱纯，纯度≥99%，北京中科质检生物技术有限公司；福林试剂、没食子酸，均为分析纯，麦克林公司；领苯二酚、2, 6-二氯酚靛酚、3,5-二硝基水杨酸、乙酸乙酯、VC、NaCl，均为分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司。

7089B-5977B HPLC-MS联用仪（美国安捷伦科技有限公司）；HHS-21-6电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司）；DF-Ⅱ数显集热式磁力搅拌器（常州爱华仪器制造有限公司）；RE-52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 采样

在宁夏中卫，采取不同成熟度的农大欧李4号果实，于果实转色期开始进行取样至成熟期，取样方法为从欧李枝的不同方位采样，混匀、去核、取汁。原料采摘时以可溶性固形物含量表示成熟度，如表1所示。

表1 果实成熟度

1.2.2 工艺流程

新鲜欧李→清洗→去核打浆→酶解→成分调整→加入SO2→接种酵母→主发酵→过滤→后酵→澄清→罐装→成品

1.2.3 操作要点

酵母活化：称取0.2 g/L活性酿酒酵母，于37 ℃水浴活化15 min，备用[7]。

去核打浆：分别选择无虫、无腐烂的不同成熟度的欧李原料，用脱核打浆机进行打浆待用。

原料预处理：取3个不同成熟度的欧李浆，料水比1∶2 g/L，向欧李发酵液中分别加入0.06 g/L蛋白酶和0.5 g/L果胶酶，于45 ℃酶解6 h。用白砂糖调整节糖度至23 °Bx。pH 3.3，按60 mg/L加入6%的亚硫酸溶液[8]。

1.2.4 不同成熟度欧李发酵

确定酵母接种量0.2 g/L、料水比1∶2 g/L、发酵温度20 ℃，选用七成熟、八成熟、完熟的3个不同成熟度的欧李进行发酵，当酒精度不再发生变化时，主发酵结束，去除沉淀，澄清过滤，取样测定。

1.2.5 欧李发酵工艺优化

1) 初糖确定：试验定位产品酒精度12%vol～13%vol，因此确定发酵初始糖度23 °Bx。试验用白砂糖进行调整。

2) 不同料水比确定：取欧李浆添加不同量的水，使料水比为1∶1，1∶2，1∶3和1∶4 g/L，在初糖22%、发酵温度20 ℃、酵母接种量0.2 g/L、pH 3.3的条件下进行发酵，当酒精度不再发生变化时，主发酵结束，皮渣分离，澄清过滤，取样测定。

3) 不同发酵温度确定：确定酵母接种量0.2 g/L、料水比1∶2 g/L、pH 3.3，设置不同温度（15，20，25，30和35 ℃）进行发酵，当酒精度不再发生变化时，主发酵结束，除酒渣，取样测定。

4) 不同接种量确定：确定发酵温度20 ℃、料水比1∶2 g/L、pH 3.3，设置不同酵母接种量（0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 g/L）进行发酵，当酒精度不再发生变化时，主发酵结束，除酒渣，澄清过滤，取样测定。

1.2.6 检测方法

单宁、总酚、单体酚含量的测定：采用HPLC-MC法进行测定。

样品前处理：用20 mL乙酸乙酯分别萃取20 mL酒样3次，合并有机相后减压蒸馏浓缩至干（＜37 ℃），以4 mL色谱甲醇溶解残渣，于-30 ℃左右避光储存，待液相检测分析，在分析测定前需使用0.45 μm有机微孔滤膜过滤处理后的样品[9]。

标准品的准备：精密称取适量没食子酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、柚皮素、诺米林、柠檬苦素、绿原酸的标准品溶于色谱醇甲醇，制得1.0 mg/mL的单标对照品溶液，备用，同时制备混标对照品溶液。

HPLC-MS色谱条件：C18（1.8 μm×100 mm×2.1 mm）色谱柱；流动相：流动相A甲醇、流动相B 0.1%甲酸水。梯度洗脱，梯度洗脱条件：0～4 min，甲醇-水（90∶10，V/V）；4～8 min，甲醇-水（80∶20，V/V）；8～12 min，甲醇-水（75∶25，V/V）；12～14 min，甲醇-水（63∶36，V/V）；14～14.6 min，甲醇-水（50∶50，V/V）；14.6～17.6 min，甲醇-水（5∶95，V/V）；17.6～18.2 min，甲醇-水（5∶95，V/V）；18.2～20 min，甲醇-水（90∶10，V/V）匀速梯度至甲醇-水（90∶10，V/V）。流速：0.8 mL/min；检测波长：270和370 nm；柱温30 ℃；进样量：10 μL[10]。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），采用正电子电离方式ESI+；离子源温度：200 ℃；雾化气体流速：1.5 L/min；脱溶温度：200 ℃；扫描范围：m/z100～1 000；扫描时间：30 min。

表2 5种单体酚类物质标准品工作曲线的回归方程

苦味评分：参照中药汤剂苦味研究[11]，对欧李酒苦味进行感官品评。苦味品评小组由接受过专业感官训练的12名学生和老师组成（男6名，女6名）。酒样被随机编号，对欧李酒进行品尝比较，将评分表的品尝结果均一化，并通过条形图表示结果。

表3 苦味评价标准

数据分析方法：所有试验平行测定3次，用M±SD表示，采用SPSS 20.0软件进行数据分析。采用Origin、Excel进行绘图。

2 结果与分析

2.1 欧李酒发酵前后酚类物质含量变化

如表4所示，酒精发酵结束后的欧李新酒中，各个单体酚发生了含量的变化。新酒中没食子酸含量较欧李果实降低0.22倍，较柚皮素降低0.66倍，较咖啡酸降低0.74倍，较杨梅素降低0.27倍。而新酒中的单宁增加幅度最大，表儿茶素含量较欧李果实增加0.15倍，较诺米林增加0.42倍，这是由于发酵可能促进植物细胞壁结构的破坏，从而导致游离酚类化合物含量增加[12]。在发酵过程中高分子量酚类可被多酚氧化酶解聚[13]，使单体酚从聚合物中游离出来。此外，某些发酵产物会导致不同单体酚之间相互转化[14]，发酵过程中儿茶素含量变化相对稳定，可能与其结构稳定性有关。酒精发酵过程中，不同单体酚之间相互转化、解聚[15]，导致其含量降低，所以新酒较发酵前苦味相对降低，口感纯正，整体平衡性好。

表4 欧李酒发酵前后酚类物质含量变化比较 单位：mg/L

2.2 发酵工艺对欧李酒多酚含量及苦味影响

2.2.1 欧李原料成熟度对欧李酒多酚含量及苦味影响由图1和表5可知，随着果实成熟度增加，酿造的欧李酒中多酚含量逐渐上升，苦味评分随之增大，直到完全熟时达到最大值，黄酮、没食子酸、儿茶素和表儿茶素含量增加幅度较大，单宁、柚皮素、咖啡酸、柠檬苦素、诺米林和杨梅素增加幅度较小，但含量均在逐渐上升。通过品尝，结果发现八成熟R-2时，欧李酒苦味最轻，口感纯正，整体平衡性好，苦味评分最低，因为在七分熟时，欧李果实糖含量低，在八成熟时，随着成熟度的增加，欧李果实在成熟期间会积累糖，含糖量上升，但多酚含量上升幅度不是很大。在欧李果实完熟时，虽然过熟的欧李果实含糖量高，酸甜可口，但是后味有苦，特别是皮中的苦比较明显，主要原因是酚类物质等活性成分含量较高，这些物质集中在皮中，所以酿造的欧李酒苦涩味较重，不适宜饮用。因此，选用八成熟的欧李果实来酿酒较适宜，苦味轻，整体风味好。

图1 不同成熟度发酵的欧李酒的苦味评分

表5 不同成熟度发酵的欧李酒多酚含量比较 单位：mg/L

2.2.2 料水比对欧李酒多酚含量及苦味影响

由图2和表6可知，随着加水比变化，多酚含量相应地变化，苦味评分也随之变化。不加水发酵的欧李酒中单宁、没食子酸、柚皮素、诺米林含量较料水比1∶1 g/L发酵的欧李酒低，这是因为一旦加水少或不加水时，制得的欧李汁相对较浓稠，进而发酵受到影响，同样会影响单宁等酚类物质的溶出。随着加水比增大，单宁、黄酮和没食子酸等10种酚类物质在酒中的含量降低，说明水量增多，酚类物质浓度会降低，酒体的苦味也随之变轻。因此，选择料水比1∶2 g/L酿酒较适宜，不影响发酵且苦味较轻。

图2 不同料水比发酵的欧李酒的苦味评分

表6 不同料水比发酵的欧李酒多酚含量比较 单位：mg/L

2.2.3 发酵温度对欧李酒多酚含量及苦味影响

由图3和表7可知，随着发酵温度变化，欧李酒中多酚含量相应地变化，苦味评分也随之变化。当发酵温度为35 ℃时，欧李酒中多酚含量最高，苦味评分最高，原因是高温发酵加剧了对劣质单宁的萃取[16]，使得单宁和黄酮含量增加。其他酚类物质均有相似的变化趋势。原因是随着发酵温度升高，酶解和发酵可能促进植物细胞壁的结构被破坏，从而导致游离酚类化合物含量增加[17]，使酒体苦涩味加重。当发酵温度在20～25 ℃时，苦味评分最低，因为低温发酵，单宁、黄酮等多酚含量较低，苦涩味轻并且可以保留较多的果香，口感质量好，因此采用20 ℃低温发酵最佳，以保留较多果香，减少对劣质单宁的萃取。

图3 不同发酵温度的欧李酒的苦味评分

表7 不同发酵温度的欧李酒多酚含量比较 单位：mg/L

2.2.4 接种量对欧李酒多酚含量及苦味的影响

由图4和表8可知，在相同的温度条件下发酵，酵母添加量对欧李酒中多酚含量有一定的影响，苦味评分随着接种量的增加而逐渐升高。这主要是因为随着接种量的增加，发酵速度也加快，原料中的一些物质不断被溶出，游离的酚类化合物含量增加[18]。同时黄酮、没食子酸、儿茶素和诺米林等多酚含量均有增加，当含量超过其阈值时，会使酒的苦涩味加重，同时酵母自身带有较多的酸性蛋白酶和酸性羧肽酶，在发酵后期菌体自溶产生生物胺等活性成分，会增加酒体的后苦味[19]，并且随着接种量的增加，发酵周期缩短，发酵速度加快，使得酵母菌代谢产物中不利的物质增多，酒体粗糙，产生较多的高级醇，也增加酒体的苦味，进而影响酒的品质和整体平衡性。因此，综合考虑选取0.2 g/L为最佳接种量。

表8 不同酵母接种量的欧李酒多酚含量比较 单位：mg/L

图4 不同酵母接种量的欧李酒的苦味评分

3 结论

试验研究了不同成熟度、发酵温度、酵母接种量和料水比对欧李酒多酚含量及苦味影响。原料成熟度越大，欧李果皮中的多酚含量就越高，所酿的欧李酒虽然香气质量高，但苦涩味重，口感差。高温发酵以及酵母菌接种量大，均会加快发酵速度，高温发酵加速了对劣质单宁的萃取，同时促进了植物细胞壁结构的破坏，从而导致单宁、黄酮等多酚物质含量增加，增加了酒体的苦味。酵母接种量大，发酵周期缩短，发酵速度加快，使原料中一些物质不断被溶出，游离的酚类化合物含量增加，同时黄酮、儿茶素、表儿茶素等多酚物质含量也在增加，当浓度超过其阈值时，会导致酒苦涩味加重，从而影响酒的品质。料水比过低，制得的欧李汁较浓稠，发酵受到影响，同样会影响单宁等多酚物质的溶出。加水比例过大，发酵酒体单薄口感不好。因此，八成熟、发酵温度20 ℃、酵母接种量0.2 g/L、料水比1∶2 g/L的发酵工艺苦味较轻，酒的品质和整体平衡性最佳。