荔枝蜂蜜醋发酵工艺优化与挥发性成分分析

潘伟杰，林捷*，郑华，陈少华，江俊梅，付章平

1. 华南农业大学食品学院（广州 510642）；2. 惠州富润康食品有限公司（惠州 516800）

蜂蜜是蜜蜂从开花植物的花蜜中收集起来，在蜂巢中经过转化、沉积、脱水等过程形成的天然甜味剂[1]。蜂蜜的营养成分丰富，含有单糖、蛋白质、酶、氨基酸、矿物质、微量元素、维生素、芳香化合物等多种有益的成分，对人体的健康有许多积极的影响[2]。研究表明蜂蜜有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等作用[3]。目前，蜂蜜的深加工产品有蜜饮料[4]、蜂蜜酒[5]、蜂蜜酸奶[6]等。

荔枝蜜是华南地区特色的蜂蜜，其香气宜人，挥发性成分种类主要包括芳香类、醇类、酮类、酯类、醛类等，有着特殊的鲜荔枝清香味[7]。蜂蜜醋是以蜂蜜为原料，经过微生物发酵而形成，产生丰富的代谢物，增加有机酸、氨基酸等营养成分，口感柔和，香气馥郁。蜂蜜醋研究大多数以总酸为指标优化工艺，未结合产品风味进行感官评价。食品的感官评定是在理化分析的基础上，通过视觉、嗅觉、味觉等感知到的食品的特征性质进行反应、测量、分析和解释的一门科学[8]。模糊数学感官评价是基于模糊数学的函数理论对影响食品感官风味评价的各因素关系进行数学运算，并建立反映其本质属性的数学评价体系的方法，结果科学客观[9]。试验以荔枝蜜为原料发酵蜂蜜醋，通过单因素试验及正交试验优化蜂蜜醋发酵工艺，并且利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法（HS-SPME-GC-MS）测定蜂蜜醋的挥发性成分。该试验为开发酸味丰富、香气浓郁的蜂蜜醋产品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荔枝蜜（70 Brix）、蜂蜜醋发酵菌（4 ℃保藏于无菌容器），惠州富润康食品有限公司提供。亚甲蓝、亚铁氰化钾、冰乙酸、硫酸、酒石酸钾钠、盐酸、乙醇、硫酸铜、酚酞、乙酸锌、氢氧化钠、无水葡萄糖等均分析纯。

1.2 仪器与设备

DGL-35B灭菌锅（浙江力辰仪器科技有限公司）；UV1240分光光度计（日本岛津仪器有限公司）；HG303-3生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；TDL-5C离心机（上海安亭科学仪器厂）；TSQ 8000 Evo三重四极杆气质联用仪（赛默飞世尔科技公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

荔枝蜂蜜→纯水稀释→巴氏灭菌→接入发酵菌种→恒温发酵→过滤→杀菌→灌装

1.3.2 试验设计

1.3.2.1 单因素试验

分别设置：菌种接种量2%，4%，6%，8%和10%；初始糖度7，9，11，13和15 Brix；发酵温度25，30，35和40 ℃。培养25 d，测定各指标，考察各因素对蜂蜜醋的影响。

1.3.2.2 正交试验在单因素试验的基础上，按照表1进行正交试验。

1.4 模糊数学感官评价法[10-11]

1.4.1 建立模糊数学模型

建立因素集：设定k1=滋味，k2=气味，k3=外观，得到蜂蜜醋模糊感官分析的因素集K={k1，k2，k3}。

建立评语集：经感官评定小组讨论确定成品蜂蜜醋评价等级：好（90）、较好（70）、差（50）；设定X1=好，X2=较好，X3=差，得到蜂蜜醋模糊感官分析的评语集X={X1，X2，X3}。

建立权重集：结合产品风味特点，将蜂蜜醋中滋味、气味、外观的权重分数分别设定为0.6，0.3和0.1；设定R1=滋味，R2=气味，R3=外观，蜂蜜醋感官分析的权重集R={R1，R2，R3}。

模糊综合评判集：模糊数学综合评定为Y=R×U，其中R为权重集，U为模糊数学矩阵，U是由每个感官因素中每一种评语的人员数除以总的评定人员得到的。

1.4.2 感官评价方法

所有蜂蜜醋样品均采用统一的容器盛装并采用3位数字随机编号，由感官鉴赏小组进行感官评价。感官鉴赏小组由10名食品专业研究生及老师组成，模糊感官评价表如表2所示。

表2 荔枝蜂蜜醋感官评价标准

1.5 测定方法

1.5.1 总酸的测定

参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》。

1.5.2 总酯的测定

参照GB/T 10345—2007中的总酯的测定方法，测定蜂蜜醋的总酯含量。

1.5.3 HS-SPME-GC-MS检测方法

参照文献[12]的方法。取8 mL蜂蜜醋饮料于SPME样品瓶中，设置孵化炉温度50 ℃，将50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头插入样品瓶中，吸附30 min后在进样口中解析5 min。色谱柱为TG-5MS（60 m×0.25 mm×0.50 μm）。升温程序：初始温度40 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升温至160 ℃，保持2 min，再以4 ℃/min升温至250 ℃，保持5 min。质谱电子能量70 eV，质量扫描范围m/z35～500。

1.6 数据分析

采用SPSS 24.0、Origin、Microsoft Excel软件对试验数据进行分析与作图。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 菌种接种量对蜂蜜醋品质的影响

由图1可知，随着接种量的增加，荔枝蜂蜜醋中总酯含量逐渐增加，总酸及感官评分呈先增加后减少的趋势，总酸最高达11.73 g/L，与刘功良等[13]研究的菌种接种量对荔枝蜜醋发酵的影响结论一致，接种量过大不利于总酸的积累。当接种量为6%时，感官评价最优，整体风味呈现出酸感柔和，香味宜人。

图1 接种量对荔枝蜂蜜醋品质的影响

2.1.2 初始蜂蜜糖度对蜂蜜醋品质的影响

菌种的发酵过程，除了产生多种有机酸，还有一些副产物如高级脂肪酸、琥珀酸等，这些物质能与乙醇作用产生酯类，赋予芳香[14]。由图2可知，随着发酵液初始糖度增加，荔枝蜂蜜醋总酯含量和感官评分持续上升，总酸含量先增加后减少，当初始糖度为13 Brix时，总酸含量达最大值。初始糖度较低时，总酸积累量较低，风味物质不够丰满；糖度过高时，菌种生长旺盛，产生大量的ATP抑制EMP途径关键酶磷酸果糖激酶的活性，且丙酮酸激酶的活性也受到抑制，导致糖酵解途径受到抑制，总酸积累量降低[15]。

图2 初始糖度对荔枝蜂蜜醋品质的影响

2.1.3 发酵温度对蜂蜜醋品质的影响

由图3可知，随着发酵温度的升高，荔枝蜂蜜醋的总酸含量和感官评分呈先增加再减少的趋势，与周文俊[16]研究温度对醋酸菌产酸产酯的影响一致，高温抑制乙醇氧化酶的活性，加速风味物质的挥发，总酸、总酯含量较低，影响产品的感官风味。在35 ℃时，总酸含量和感官评分达最大值，此时蜂蜜醋香气浓郁，口感清爽。

图3 发酵温度对荔枝蜂蜜醋品质的影响

2.2 模糊感官数学评价法优化正交试验结果

2.2.1 模糊感官数学评价

由10名感官评价成员对正交试验9组的蜂蜜醋进行感官评价，评定结果见表3，表中数字表示各等级评价的人数。以样品385为例，滋味评分在40～60分有3人，19～39分有5人，1～18分有2人。

表3 蜂蜜醋感官评价结果 单位：人

2.2.2 建立模糊评价矩阵

参考张佳汇等[10]的方法。以编号136的样品为例。将蜂蜜醋感官评价结果各等级评价人数分别除以总感官评价人数，建立滋味、气味、外观的模糊评价矩阵，分别为：u1=[0.8 0.2 0]，u2=[0.7 0.3 0]，u3=[0.9 0.1 0]。则样品136的模糊感官评价矩阵U1可以表示为：

2.2.3 模糊数学感官评价综合分析

模糊数学综合评定为Y=R×U，以编号136的样品为例，其模糊数学综合评价为：

同理，得到各组蜂蜜醋的模糊数学感官评价结果，然后分别乘以评语集X={X1，X2，X3}={好，较好，差}={90，70，50}。求和得到各组的模糊数学感官评价结果，如表4所示。根据模糊数学感官评价分析，样品136的综合评分最高，达到85.6分，说明其感官风味最佳，受到感官评价人员的喜爱。结合表5可知，样品136酸度较高，酸感柔和，蜜香浓郁。

表4 正交组蜂蜜醋感官评价结果

2.2.4 正交试验结果分析

由表5可知，影响模糊感官评分的主次因素排序为初始糖度＞温度＞接种量。正交试验分析以模糊感官评分为主要指标，化学指标作为参考。样品136模糊感官评分最高，综合其滋味、气味和外观，受到感官评定人员的认可。依据K值分析可知，蜂蜜醋发酵工艺优化最佳试验方案为A1B2C3。以最佳试验方案进行验证试验，测得蜂蜜醋总酸13.68 g/L、总酯86.73 mg/L。通过模糊感官评价分析，感官评分为86.8分。

表5 蜂蜜醋发酵工艺优化正交试验结果与分析

2.3 HS-SPME-GC-MS结果

用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HSSPME-GC-MS）法测定蜂蜜醋发酵的挥发性物质，结果见表6。共测得56种挥发性成分。其中酸类物质有5种，醇类物质有6种，酯类物质有14种，酮类物质有10种，醛类物质有8种，呋喃类物质7种。所有挥发性成分中酸类物质含量为67.21%，占比例最多。其次是醇类物质14.83%，酮类物质10.19%，酯类物质2.82%，呋喃类物质1.57%，醛类物质1.71%。可见，酸类、醇类、酮类、酯类物质是荔枝蜂蜜醋挥发性香味物质的主要化合物。与马磊[17]研究的荔枝蜜醋进行比较，可以发现共同的化合物有苯乙醇、苯乙酸乙酯、异丁酸、壬醛、辛醛等。

表6 蜂蜜醋挥发性化合物HS-SPME-GC-MS结果

乙酸占总挥发性物质的55.85%，是醋的主要挥发性风味成分，主要提供醋酸味、醋香味。异戊酸和异丁酸含量较高，异戊酸主要贡献酸味，异丁酸带有酸味和奶酪香气，和黄丹等[18]研究一致，酯类化合物是食醋中种类最多的一种化合物。酯类物质大多具有水果香，乙酸乙酯具有苹果、香蕉的香气，乙酸异戊酯具有梨的甜香味，是蜂蜜醋重要的呈香物质。酮类物质中乙偶姻、3-乙酰基-2-丁酮和2, 3-丁二酮含量较高。其中乙偶姻为8.39%，具有奶油香和甜香，是蜂蜜醋重要的香气成分。醇类物质中氧化芳樟醇含量为14.36%，具有玫瑰花香、樟脑木香、甜味。醛类物质中壬醛具有甜橙味、玫瑰花香，糠醛具有焦糖味，苯甲醛有果香、杏仁味，辛醛具有橘子水果味[19-20]。这些物质共同构成蜂蜜醋独特的风味。

接表6

3 结论

模糊数学法可以更加客观地对产品进行感官评价，弥补仅靠理化指标优化工艺参数的缺陷。结合总酯、总酸等指标，优化蜂蜜醋发酵工艺，确定菌种接种量4%、发酵温度25 ℃、蜂蜜发酵液糖度15 Brix。该条件下发酵形成的蜂蜜醋口感丰富、酸味柔和、香味浓郁，有明显光泽，模糊数学感官评分为86.8分。通过HS-SPME-GC-MS法测定蜂蜜醋挥发性风味物质，测得56种挥发性化合物，其中酸类物质有5种（67.21%），醇类物质有6种（14.83%），酯类物质有14种（2.82%），酮类物质有10种（10.19%），醛类物质有8种（1.71%），呋喃类物质7种（1.57%），这些化合物共同构成蜂蜜醋独特的醋香风味。