地涌金莲酵素的发酵工艺及其抗氧化活性研究

刘晓雪，李瑞杰，彭婉芊，白忠彬，田洋*，宋爽*

1. 云南农业大学食品科学技术学院（昆明 650201）；2. 国家辣木加工技术研发专业中心（昆明 650201）；3. 云南省生物大数据重点实验室（昆明 650201）

地涌金莲，拉丁学名Musella lasiocarpa（Franch.）C.Y. Wu ex H. W. Li，原产于中国云南省，是中国特产花卉[1]。其可用于药用[2]、食用、饲料[3-4]、观赏、造纸、纺织、水土保持及生态修复等[5-9]。由于人工合成的抗氧化剂对生物体有潜在的致癌、致畸变[10]，而天然性功能食品不仅具有良好的抗氧化和清除自由基能力，而且对机体没有任何毒副作用，使之成为抗氧化活性物质领域研究的新方向。

酵素（enzyme）是一类风靡我国的植物保健食品[11]，其主要功能包含帮助体内废物排出、消炎作用、抗菌作用、净化血液、促进细胞新生等[12-15]。作为一类保健产品以其天然、无副作用的特点广受追捧，相关研究证明酵素有增加消化酶及降脂的效果[16-18]。也有研究表明酵素具有增强抗氧化能力及提高免疫力作用等[19-21]。我国对酵素的研究还比较匮乏，并未对其进行充分的开发和利用[22]。因此，试验通过对地涌金莲发酵后的细胞抗氧化及对细胞受损模型的保护作用进行研究，评价地涌金莲酵素的保健功效，以体现地涌金莲开发保健食品价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

地涌金莲（云南晋宁县地区）；植物乳杆菌（广东省微生物菌种保藏中心）；人肝癌株细胞（Hep-G2，上海名劲生物科技有限公司）；DMEM高糖培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（FBS，美国Hyclon公司）；胰蛋白酶（美国Amresco公司）；磷酸缓冲溶液（PBS）、四甲基偶氮唑盐（MTT），均为美国Amresco公司；二甲基亚砜（DMSO）、双抗，均为美国Amresco公司；无水乙醇、四氯化碳（均为天津市风船化学试剂科技有限公司）；没食子酸（上海索莱宝生物科技有限公司）。

二氧化碳培养箱[美国热力（Thermo）公司]；多功能酶标仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；80-2低速离心机（常州澳华仪器有限公司）；UBT3000生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 地涌金莲原汁液发酵工艺的研究

1.2.1.1 地涌金莲原汁液发酵工艺流程

原料选择与处理→成分配比→混匀→接种前灭菌→接种乳酸菌→发酵→发酵液→离心→过滤→成品

1.2.1.2 操作要点

1.2.1.2.1 原料选择与处理

选用云南省晋宁县优质地涌金莲，将地涌金莲榨成的汁液与纯净水按照一定的体积比例混合，并搅拌均匀，成为原料液待用。

1.2.1.2.2 灭菌

将置于大锥形瓶中并用封口膜密封好的发酵原料液于121 ℃灭菌30 min，用冰水以水浴的方法将发酵原料液快速冷却到4～5 ℃，置于洁净工作台。

1.2.1.2.3 发酵

将活化选育的乳酸菌按2%菌种量接种到灭菌后的发酵原料液中，用封口膜密封好摇匀，于37 ℃恒温生化培养箱中进行发酵[23]。

1.2.2 地涌金莲酵素发酵工艺试验设计

1.2.2.1 工艺条件优化单因素试验

在植物乳杆菌添加量2%的条件下，对料液比（1∶9，2∶8和3∶7 g/mL）、发酵时间（2，3和4 d）、发酵温度（30，33和35 ℃）进行单因素试验，以感官评分为指标，确定最适工艺参数。

1.2.2.2 工艺条件优化正交试验设计

从单因素发酵试验过程中初步确定3个因素的最优工艺范围，为提高产品品质和产量，确定发酵过程中各个参数的最优工艺条件。以感官评价分数作为考察指标，设计正交试验（如表1）并进行分析，得到发酵的最优工艺参数。

表1 L9(33)地涌金莲酵素发酵正交试验设计

1.2.3 感官评定测定

感官评价邀请从事食品产品开发相关人员及其他实验室非食品专业同学共计20人，对地涌金莲酵素的风味、口感、色泽、澄清度4个评价指标进行感官评分，参加感官评价的人员在评价前6 h内未曾食用具有辛辣刺激的饮食，评分具有可信性。

表2 地涌金莲酵素感官评分标准

1.2.4 抗氧化活性试验

参照文献[23]进行，略加改进。取ABTS（7 mmoL/L）与过硫酸钾（2.45 moL/L）按1∶1比例充分混合均匀后，室温避光放置12～16 h，得到ABTS+·自由基储备液，备用，使用时用无水乙醇稀释40～50倍得到工作液（吸光度在0.68～0.72之间），该工作液在30 ℃，734 nm波长下吸光度为0.70±0.02（乙醇调零）。用移液枪吸取100 μL多酚粗提物，加入3.8 mL ABTS+工作液，室温下放置6 min，用甲醇作为空白，在紫外可见分光光度630 nm下测定样品的吸光度[27]，据式（1）计算清除率，并计算出EC50（半数抑制率）。

1.2.4.2 DPPH自由基清除活性测定

参照文献[23]进行，略加改进。准确称取0.8 mg DPPH，用乙醇溶解，定容至烧杯（200 mL）中，配成浓度1 mmol/L的DPPH母液。测定时用乙醇稀释10倍配成0.1 mol/L的DPPH反应液。用移液枪吸取1 mL多酚粗提液，添加4 mL浓度0.1 mol/L DPPH反应液，充分摇匀后，暗处放置30 min，用甲醇作为空白，在520 nm波长下测吸光度[27]，据式（1）计算清除率，并计算EC50值。

1.2.4.3 MTT法建立CH3CH2OH和CCl4氧化损伤模型

将人肝癌Hep-G2细胞按2.0×104cells/孔的浓度接种到2个96孔板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，细胞贴壁生长后，弃去上清液，将细胞分为正常对照组、不同浓度的CH3CH2OH模型组1和不同浓度的CCl4模型组2，正常对照组加入100% DMEM（含1%双抗）培养液，模型组1分别加入含CH3CH2OH不同浓度的培养基，模型组2加入含CCl4不同浓度的培养基，培养12 h。建模结束后，加入质量浓度5 mg/mL的MTT溶液，每孔20 μL，继续置于培养箱中培养4 h，终止培养，小心吸弃孔内上清液，加入DMSO，每孔200 μL，振荡10 min，492 nm波长下测定吸光度，并计算细胞存活率。选取细胞相对存活率在50%左右的CH3CH2OH和CCl4致损浓度，作为后续试验对肝细胞的损伤浓度。

1.2.4.4 地涌金莲对损伤细胞的保护作用

接细胞见1.2.4.3小节。分别加入含不同浓度样品的培养液，每个浓度设6个复孔，每孔200 μL，设置对照组、损伤组和保护组，对照组用100% DMEM培养液，损伤组和保护组都分别加入4%浓度的CH3CH2OH培养液和5 mmol/L浓度的CCl4培养液，继续培养12 h；12 h后，保护组加入不同浓度的地涌金莲酵素，加样品后置于CO2培养箱中培养12 h，加入MTT溶液（5 mg/mL），每孔20 μL，置于培养箱中继续培养4 h，弃上清液后加入DMSO，每孔200 μL，振荡10 min，选择492 nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度（OD值），10 min内测定完成后计算细胞相对存活率。

1.3 数据处理

每个试验重复3次，试验结果用“均数±标准差”表示。数据结果采用Excel 2007软件进行分析，带入Graphpad prism5软件进行绘制柱形图和分析显著性差异。

矿区内以往工作求得333+334类多金属矿石量为120.337万吨，金属量为45 289 t，其中铜为13 094 t、铅为16 747 t、锌为15 448 t、硫为144 901 t，可达小型规模。目前江西省地勘基金和中央地勘基金在矿区内联合开展工作，找矿工作已取得一定的进展，在15线、20线、36线、40线均发现多层铜矿体，其厚度为1～18.36 m，铜品位为0.27%～13.3%，往深部矿体有变厚变富的趋势。

2 结果与分析

2.1 地涌金莲酵素的工艺条件优化单因素结果

2.1.1 料液比对地涌金莲酵素发酵的影响

在植物乳杆菌添加量2%、发酵温度35 ℃、发酵时间4 d的条件下，调节料液比，设置3个不同料液比的组分，分别为1∶9，2∶8和3∶7 g/mL，每个组分设置3个平行，进行发酵，结果得出不同料液比对地涌金莲感官评分有明显影响，且料液比3∶7 g/mL时，感官评分最高。

图1 料液比对地涌金莲发酵的影响

2.1.2 发酵时间对地涌金莲发酵的影响

在料液比3∶7 g/mL、植物乳杆菌添加量2%、发酵温度35 ℃的条件下，调节发酵时间，设置3个不同发酵时间的组分，分别为2，3和4 d，每个组分设置3个平行，进行发酵，以多感官评价为考察指标，得出发酵时间4 d的感官评分最高。

图2 发酵时间对地涌金莲发酵的影响

2.1.3 发酵温度对地涌金莲酵素的影响

在料液比3∶7 g/mL、植物乳杆菌添加量2%、发酵时间4 d的条件下，调节发酵温度，设置3个不同发酵温度的组分，分别为30，33和35 ℃，每个组分设置3个平行，以感官评价为考察指标进行分析，得出发酵温度33 ℃时感官评分最高。

2.2 地涌金莲酵素的工艺条件优化正交试验设计及结果

在单因素结果基础上，采用正交试验法，以地涌金莲发酵饮料的感官评价分数为指标，对其料液比、发酵温度、发酵时间3个因素进行考察，根据正交试验表L9(33)进行试验，筛选出最佳提取工艺条件。

由表3正交试验结果可知，三因素对地涌金莲发酵效率的影响的主次关系依次是RB＞RA＞RC，即地涌金莲发酵过程中，发酵时间＞料液比＞发酵温度。比较各ki值可知，发酵的最佳工艺组合为B3A3C2，即发酵时间4 d、料液比3∶7 g/mL、发酵温度33 ℃，该组合在试验组中，得到的感官评价平均分数为83分。

图3 发酵温度对地涌金莲发酵的影响

表3 地涌金莲酵素正交试验表

2.3 地涌金莲酵素的抗氧化活性

由表4可知，地涌金莲酵素随着质量浓度的增加（25～200 μg/mL），ABTS自由基清除率逐渐上升，没食子酸当量浓度也随之上升。经计算，地涌金莲酵素EC50约57 μg/mL，没食子酸约101 μg/mL，证明地涌金莲酵素对ABTS自由基具有一定清除能力，且清除效果强于没食子酸。

表4 地涌金莲酵素对ABTS自由基的清除作用（±s）

表4 地涌金莲酵素对ABTS自由基的清除作用（±s）

浓度/(μg·mL-1) 清除率/% 没食子酸当量质量浓度/(μg·mL-1)25 23.06±6.45 40.89±3.62 50 48.25±5.37 78.47±5.41 100 79.06±8.53 143.16±10.89 200 93.21±9.82 208.36±12.78地涌金莲酵素质量

由表5可知，地涌金莲酵素清除DPPH自由基的清除也随着浓度的增加而升高，相对没食子酸当量浓度也增加，与ABTS的试验结果相似。酵素和没食子酸的EC50分别约33和87 μg/mL，证明地涌金莲酵素对DPPH自由基也具有一定清除能力，且清除效果明显强于没食子酸。

表5 地涌金莲酵素对DPPH自由基的清除作用（±s）

表5 地涌金莲酵素对DPPH自由基的清除作用（±s）

浓度/(μg·mL-1) 清除率/% 没食子酸当量质量浓度/(μg·mL-1)25 30.82±4.82 33.45±7.87 50 62.74±3.58 74.36±10.66 100 93.21±8.28 150.61±8.49 200 120.36±7.64 215.94±8.65地涌金莲酵素质量

2.4 Hep-G2细胞CH3CH2OH和CCl4氧化损伤模型建立

由不同浓度CH3CH2OH和CCl4培养12 h后的Hep-G2细胞活性测定结果（图4）可知，随着CH3CH2OH和CCl4浓度增加，细胞相对存活率逐渐下降，浓度8%和8 mmol/L时，存活率仅有12.98%和34.14%，大部分死亡，说明Hep-G2细胞对CH3CH2OH和CCl4较为敏感，用CH3CH2OH和CCl4建立Hep-G2细胞的氧化损伤模型是可行的。CH3CH2OH和CCl4浓度为4%和5 mmol/L时，两细胞的存活率与正常对照组差异显著，分别为55.20%和52.96%，接近50%～60%，因此选取该浓度作为建立后续Hep-G2细胞的氧化损伤模型。

图4 不同浓度CH3CH2OH和CCl4对Hep-G2细胞活力影响

2.5 地涌金莲酵素对CH3CH2OH和CCl4氧化损伤细胞的保护作用

通过图5可知，在相同CH3CH2OH浓度（4%）和CCl4浓度（5 mmol/L）致损下，模型组的Hep-G2细胞存活率分别只有56.49%±9.23%和51.66%±14.43%，但是加入不同浓度的地涌金莲酵素与其共同作用后发现细胞存活率均高于模型组值，即地涌金莲酵素可有效降低CH3CH2OH和CCl4诱导Hep-G2细胞的氧化损伤作用。但是地涌金莲酵素并不是随着浓度的升高，对细胞的保护作用增强，这说明不同浓度地涌金莲酵素与氧化损伤剂之间可能存在对抗作用，而地涌金莲酵素却能起到很好的抗氧化作用。

图5 不同浓度地涌金莲酵素对Hep-G2损伤细胞的保护作用

3 结论

地涌金莲原料液发酵的最佳工艺条件是料液比1∶3 g/mL（25%）、植物乳杆菌添加量2%、发酵温度37 ℃、发酵时间4 d，最优条件下得到的感官评价分数是83分。地涌金莲酵素风味独特，清爽无异味，口感柔滑，酸度适宜，回味较醇厚，色泽呈淡黄色，色泽较为诱人，较澄清透明，无沉淀，综合得分83分。地涌金莲发酵液对ABTS和DPPH自由基均有一定清除能力，CH3CH2OH和CCl4建立的氧化损伤体外模型在统一处理12 h后，Hep-G2细胞存活率达到50%左右的浓度分别为4%和5 mmol/L。不同浓度地涌金莲酵素对经CH3CH2OH和CCl4氧化损伤的Hep-G2细胞保护作用最好的浓度分别为10%和15%。