灵芝子实体多糖和三萜含量变化规律

游俊健，叶志伟，郑倩望，刘英丽，林俊芳*，郭丽琼*

1. 华南农业大学食品学院生物工程系（广州 510642）；2. 北京工商大学中国-加拿大食品营养与健康联合实验室（北京）（北京 100048）；3. 广东省微生态制剂工程技术研究中心（广州 510640）

灵芝是担子菌纲、多孔菌目、多孔菌科、灵芝属[1]真菌，2019年国家卫生健康委员会认定灵芝为食药同源物质（食品函[2019]31号）。灵芝作为中国传统珍贵食药同源物质，含有多种活性成分，灵芝多糖和三萜类化合物被认为是灵芝的关键药效成分，现已有400多种化合物被鉴定，其中有300多种是三萜类化合物[2]。灵芝多糖具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、抗糖尿病、调节免疫功能[3]等多种生物活性[4-6]；灵芝三萜具有抗氧化[7]、抗肿瘤[8-9]、保护肝脏[10]、抗HIV蛋白[11-12]、降低胆固醇[13]等广泛的药理活性。

灵芝的多糖和三萜含量与品种及栽培方式关系密切，不同的灵芝品种其多糖与三萜含量不同。齐川等[14]研究发现了不同品种的灵芝其多糖含量和三萜含量差异很大；宋婷婷等[15]测定不同品种灵芝子实体中多糖和三萜含量，结果发现其差异显著。栽培方式影响灵芝多糖和三萜含量。孙恬等[16]发现蓝光利于灵芝子实体活性成分的提高；霍光明等[17]研究了不同栽培基质对灵芝多糖含量的影响。此次试验以赤芝（Ganoderma lucidum）、鹿角灵芝（Ganoderma amboinense）、金大灵芝（Ganoderma lucidum）、硫因灵芝FQ16（Ganoderma sessile）为研究材料，探究栽培料质量对不同品种灵芝子实体产量及其多糖和三萜含量的影响，同时对灵芝不同成熟期的多糖和三萜含量变化规律进行研究。该结果旨在指导灵芝生产过程中以最低的栽培培养基成本获得最高的产量和最高的活性成分含量以及最佳的采收时间。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试菌种赤芝（Ganoderma lucidum）、鹿角灵芝（Ganoderma amboinense）、金大灵芝（Ganoderma lucidum），购自北京吉蕈园科技有限公司；硫因灵芝FQ16（Ganoderma sessile），实验室采集并鉴定。以上菌种均保存在华南农业大学食品学院食品组学与健康实验室。

葡萄糖、琼脂粉（广州环凯生物公司产品）；苯酚、浓硫酸、冰乙酸、高氯酸、无水乙醇（广州化学试剂厂产品）；七水合硫酸镁、磷酸二氢钾（广州光华化学厂有限公司产品）；齐墩果酸（上海瑞芳德化工有限公司产品）；香草醛（上海达瑞精细化学品有限公司产品）。

1.2 仪器与设备

Ultra Bioscience超纯水仪（英国Elga公司）；LRH-70生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；Universal 16R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；SW-CJ-1F超净工作台（江苏苏州安泰空气技术有限公司）；101A-3S电热鼓风干燥箱（广东广州富民测控科技有限公司）；电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司）；752紫外可见光分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；自动灭菌锅（山东新华医疗器械股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化与栽培

灵芝子实体栽培配方为（100 g）：98 g棉籽壳、1 g过磷酸钙、1 g石膏、150 mL水。使用PDA培养基活化上述4种灵芝菌株。将已活化的灵芝菌株转接至PSB培养基中，于27 ℃摇瓶培养10 d，作为种子液。将种子液接种到栽培袋中，每袋接种10 mL，27 ℃避光培养至菌丝长满栽培袋。打开栽培袋口，于25 ℃、湿度90%、光照环境下培养。

1.3.2 灵芝不同生长期的确定

观察灵芝子实体菌盖生长程度，参考文献[18]将灵芝子实体发育分为3个不同阶段，即芝盖形成期、芝盖生长期和成熟期。

表1 不同生长发育期灵芝子实体形态特征

1.3.3 子实体栽培与预处理

试验按栽培料干重设置4组处理分别为：545 g（T1），621 g（T2），697 g（T3）和773 g（T4），按常规栽培灵芝方式进行栽培，每组处理每种菌株分别栽培30袋。待灵芝子实体生长至成熟期后进行采摘，采摘后子实体进行称重和记录，所得质量为灵芝产量。

新鲜子实体称重后需进行预处理。先将新鲜子实体表面清洗干净，后置于110 ℃烘箱2 h烘干，接着转入60 ℃烘箱中烘干至恒重，最后使用粉碎机将干燥至恒重的子实体粉碎至絮状，用研钵粉碎絮状物后过40目筛，保存在干燥箱中备用。经预处理后灵芝子实体可用于测定多糖和三萜含量试验。

通过上述测定多糖和三萜含量试验的数据分析，选择4种灵芝中多糖和三萜含量均较高的品种作为后续研究不同生长阶段灵芝子实体多糖和三萜含量的变化规律的菌株。

1.4 灵芝产量与生物转化率测定

对新鲜采摘的灵芝子实体进行称重，新鲜子实体质量为灵芝产量。生物转化率按式（1）计算。

式中：α为生物转化率，%；m0为新鲜灵芝子实体质量，g；m1为栽培料质量，g。

1.5 灵芝子实体多糖与三萜含量测定

1.5.1 灵芝子实体多糖含量测定

根据文献报道[19]采用苯酚-硫酸法对灵芝子实体多糖含量进行测定。以葡萄糖为标准品绘制标准曲线，得到多糖直线回归方程：

式中：y为吸光度；x为多糖质量，μg；R2=0.998 9。

1.5.2 灵芝子实体三萜含量测定

根据文献[19]报道，采用香草醛-高氯酸显色反应对灵芝子实体三萜含量进行测定。以齐墩果酸为标准品绘制标准曲线，得到回归方程：

式中：y为吸光度；x为三萜质量，mg；R2=0.992 9。

1.5.3 数据处理

灵芝子实体多糖与三萜含量测定试验均重复3次，每次制作10个平行。采用SPSS 21.0和Excel 2016数据处理软件对试验数据进行分析。

2结果与分析

2.1 栽培料质量对灵芝产量、多糖和三萜含量影响

2.1.1 栽培料质量对灵芝子实体产量的影响

栽培料质量对灵芝产量的影响结果见表2。相同灵芝品种不同栽培料质量处理，金大灵芝与灵芝FQ16产量在T4处理组显著高于T1处理组；但赤芝与鹿角灵芝产量在处理组间均无显著差异，可见栽培料质量对不同灵芝菌种产量的影响不同，因此要获得灵芝最大收益需要合适质量的培养基质。综上，若使用本栽培配方和菌株进行栽培，从成本等条件综合考虑，选择栽培料质量545 g为最佳，经济成本最低。

表2 栽培料质量对灵芝产量的影响 单位：g

2.1.2 培养料质量对灵芝活性成分含量的影响

栽培料质量对灵芝多糖和三萜含量的影响结果见3与表4。随栽培料质量增加，金大灵芝和鹿角灵芝子实体多糖含量在处理组间无显著差异，而赤芝T3与T4处理组多糖含量有显著差异，硫因灵芝FQ16的T1与T3处理组多糖含量有显著差异。不同品种灵芝多糖含量变化无相似规律。

表4 栽培料质量对灵芝三萜含量的影响 单位：mg/g

随栽培料质量增加，赤芝和鹿角灵芝三萜含量在T1和T4处理组间有显著差异，T4高于T1处理组；金大灵芝T3与T4处理组有显著差异，T3高于T4处理组；硫因灵芝FQ16处理组T1与T3有显著性差异，T1高于T3处理组。可见灵芝中三萜含量随栽培料质量增加呈无规律变化。

相同处理组中不同灵芝品种，在4种灵芝多糖含量有显著差异，但在三萜含量里除T1处理组外，其他处理组中赤芝、金大灵芝与硫因灵芝FQ16无显著差异。4种灵芝中金大灵芝平均多糖含量最低，达21.85±1.31 mg/g，但三萜平均含量较高；鹿角灵芝平均多糖含量最高，达63.94±3.00 mg/g，但三萜平均含量最低；其中硫因灵芝FQ16多糖平均含量中等，为41.76±2.36 mg/g，三萜平均含量最高，为6.47±0.30 mg/g。由此可见灵芝中多糖与三萜含量与菌株种类有关，随栽培料质量增加呈无规律变化。

从以上结果得出，研究考究子实体在不同成熟期多糖与三萜含量所选用的栽培料配方与上面研究相同，因此选择子实体多糖和三萜含量在所选菌株中均较高的硫因灵芝FQ16作为后续研究的试验材料。

表3 栽培料质量对灵芝多糖含量的影响 单位：mg/g

2.2 灵芝子实体不同成熟度活性成分含量分析

从表5可以看出，芝盖形成期、芝盖生长期和成熟期的灵芝子实体多糖含量随成熟度的增加呈下降，且不同成熟度之间差异显著。其中多糖含量最高为芝盖形成期的子实体，含量达到61.31±2.92 mg/g。同时三萜含量随子实体成熟度增加呈上升，且不同成熟度之间差异显著。三萜含量最高为成熟期，含量达到8.92±0.78 mg/g。结果表明需要获得多糖含量较高的产品应在灵芝的芝盖形成期进行采摘，需要三萜含量较高的产品应在灵芝的成熟期采摘，如果需要两者含量均较高的灵芝子实体，可在芝盖生长期进行采摘。

表5 不同发育期硫因灵芝FQ16子实体多糖与三萜含量差异 单位：mg/g

3 讨论与结论

研究根据不同栽培料质量分为4个处理组栽培4种不同灵芝，结果表明了灵芝产量不一定会随着栽培料质量增加而发生变化，因此，生产上要获得最佳的经济效益要有合适的培养基质质量。影响灵芝产量与转化率较为关键的因素应是栽培配方的选择，研究中鹿角灵芝产量与生物转化率均明显低于其他3种灵芝菌株，对比其他栽培鹿角灵芝的报道[20-22]，研究采用的栽培料可能不适合用于栽培鹿角灵芝。在实际生产过程中为了获得较高灵芝产量，不应盲目增加栽培料质量避免浪费和增加生产成本，应按实际生产所用菌株进行试验设计和选择合适栽培料，从而得到灵芝产量和生物转化率较高、成本较低的栽培条件。

不同栽培料质量栽培4种不同灵芝，灵芝中多糖与三萜含量与菌株有关，多糖和三萜含量随栽培料质量增加均呈无规律变化。在生产过程中，根据实际生产需求选择合适的菌株是关键。已有较多利用现代生物工程技术培育高产多糖与三萜灵芝菌株的报道[23-25]。那么多糖与三萜含量是否有互相影响的因素存在，Ye等[26]用Ca2+和水杨酸对灵芝进行栽培，考察灵芝多糖和三萜产量变化，结果水杨酸处理显著提高三萜产量但对多糖产量无显著影响，水杨酸和Ca2+联合诱导同时提高了三萜和多糖产量。由此得出灵芝中多糖和三萜含量或无互相影响因素存在。

灵芝子实体多糖与三萜含量在4种灵芝不同生长期间均有显著差异，且随灵芝成熟度提高，多糖含量呈下降趋势，三萜含量呈上升趋势。关于灵芝在不同生长期间多糖和三萜含量的研究已有较多报道[27-29]，以上文献产生多种结果，推测是因为选择栽培的菌株不同导致。

在灵芝栽培生产过程中，根据所用灵芝菌株与产品要求，应先对选用菌株进行合适栽培料种类与栽培料质量研究，得到适合培养且成本低廉的栽培条件。同时研究该灵芝菌株子实体拥有最高多糖或三萜含量的生长期，在相应生长期进行采收，从而获得优质产品。