不同澄清剂对枳椇果酒澄清效果

黄萧天，巴特，魏丕伟*，王凌云，何发明，王江林

四川轻化工大学（宜宾 644000）

枳椇（Hovenia dulcis）为鼠李科拐枣属落叶乔木[1]，始载于《唐本草》，别名拐枣、龙爪、鸡爪果、万寿果等，被国家卫计委列入食药两用中药名单。主要分布在四川、广西、湖北、广东、贵州等省份[2]。枳椇成熟的肉质果梗中含有丰富的营养成分和生理活性物质，主要包括生物碱、活性黄酮类物质、三萜皂苷类、苯丙素类、多糖等[3-5]；因此枳椇也含有很多功效，如减肥降脂[6]、保肝解酒[7]、抗肿瘤[8]、增加免疫力与抗疲劳[9]等，是一种极具开发利用的植物资源，经过发酵制成的枳椇果酒也继承了枳椇其丰富的营养和独特的风味，具有良好的药用价值与市场价值。

由于枳椇本身含有较多的蛋白质、果胶、色素等[10]物质以及受生产工艺条件的影响，枳椇果酒在储存过程中会出现浑浊、失光等现象，严重影响枳椇果酒的品质。因此为提高枳椇酒的品质、延长其货架期、增强其稳定性，需对枳椇果酒进行澄清工艺优化及稳定性检测。试验选取明胶、皂土、壳聚糖、硅藻土、果胶酶5种澄清剂，进行单因素澄清试验，并选择3款最佳的澄清剂进行正交试验，得出最佳复合澄清剂配比，结合稳定性试验，确定合理有效的澄清方法，以期为枳椇酒的生产加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

枳椇干果（产地湖北黄冈）；酿酒酵母（安琪葡萄酒酵母）；明胶（成都金山化学试剂有限公司）；皂土（上海试四赫维化工有限公司）；果胶酶（法国LAIFEMAND公司）；壳聚糖（郑州万博食品配料有限公司）；壳聚糖（郑州万博食品配料有限公司）；硅藻土（成都科龙化工试剂厂）；芦丁（合肥博美生化科技有限责任公司）；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 试验仪器

UV-5500PC紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；HS-2数显恒温水浴锅（太仓市华利达实验设备有限公司）；TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；FA2204N电子天平（常州市衡正电子仪器有限公司）；GZ-250-HSII恒温培养箱（韶关市广智科技设备有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 枳椇果酒的发酵工艺流程

枳椇→烘干→研磨→加水混匀→偏重硫酸钾处理→超声波微处理→酶解→45 ℃水浴恒温2 h→调pH 5.0→调糖度20%→发酵→澄清→过滤→成品→检测

1.3.2 理化指标的测定

1.3.2.1 酒精度

按照GB 5009.225—2006[11]规定的方法测定。

1.3.2.2 黄酮质量浓度

1) 芦丁标准曲线的测定

芦丁标准溶液的配制：精密称取芦丁对照品19.5 mg，加入蒸馏水定容至100 mL。取芦丁标准品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 mL分别放置在25 mL试管中，加入30%乙醇溶液至6.0 mL，分别加入5%NaNO2的溶液和10%的Al(NO3)3溶液各1 mL，分别加入4% NaOH溶液10 mL。摇匀，静置6 min，用空白溶液（蒸馏水）做参照。用紫外可见分光光度计在波长510 nm处测定其吸光度A，以吸光度为纵坐标、芦丁浓度为横坐标绘制标准曲线。

2) 枳椇果酒黄酮质量浓度的测定

以1 mL枳椇果酒代替芦丁标准品溶液，并按照上述标准曲线回归方程计算黄酮质量浓度。

1.3.3 澄清度波长的选定

采用全波段扫描的方式，在400～800 nm下进行扫描，选择最低吸光度下对应的波长。

1.3.4 澄清剂的配制1%明胶溶液[12]、1%硅藻土溶液[13]、10%皂土溶液[14]、1%壳聚糖溶液[15]、1%果胶酶溶液[16]。

1.3.5 单因素试验

取10 mL发酵7 d的枳椇果酒于试管中，分别按表1试验方案加入澄清剂，迅速震荡摇匀，室温静置48 d，取上清液，在最佳波长下，测其透光率，并且按照1.3.2的方法，测定枳椇果酒中黄酮质量浓度。

表1 5种澄清剂单因素试验水平

1.3.6 正交试验

根据单因素试验结果，选取3种澄清效果最佳的澄清剂，在单因素的试验基础上采用三因素三水平的正交试验，确定复合澄清剂的最佳配比，并取最适配比做3个重复试验，验证其可行性。

1.3.7 稳定性试验

根据澄清试验结果，选取最佳澄清工艺处理果酒，并取上清液做稳定性试验，包括蛋白质稳定性、铁稳定性、铜稳定性、氧化稳定性、生物稳定性[17-20]。

2 结果与分析

2.1 枳椇果酒的理化指标

2.1.1 枳椇果酒黄酮质量浓度

由1.3.2得到线性回归方程为y=9.808 2x-0.004 2，R=0.999 5。结果表明，芦丁标准品质量浓度在0.00～6.08 mg/mL范围内与吸光度呈现良好的线性关系，并测得枳椇果酒在510 nm下的吸光度为0.14，根据该方程，可以算出枳椇果酒中黄酮质量浓度为14.70 mg/L。

2.2 澄清度波长的测定

对枳椇果酒进行400～800 nm的波段扫描，随着波长增加，吸光度逐渐减小直至平衡，波长为680 nm时，吸光度达到最低，此时的透光率最大，因此，选用680 nm作为枳椇果酒最佳澄清波长。与之相对应的吸光度为0.103，此时的透光率为78.8%。

2.3 枳椇果酒澄清工艺的单因素试验结果

2.3.1 明胶添加量对枳椇果酒澄清效果的影响

明胶作为果酒常用澄清剂，可结合中单宁并吸附其他杂质形成沉淀[21]。由图2所示，在明胶添加量范围内，透光率呈先上升后下降趋势，添加量5.0 g/L时，透光率达到最大值64.60%。随添加量增大，透光率明显下降，可能是由于酒中单宁含量过少，过量的明胶本身就会形成悬浮物，导致澄清度下降[22]。但最佳透光率64.60%显著低于枳椇果酒原来的透光率78.8%，因此不采用明胶澄清枳椇果酒。

图2 明胶添加量对枳椇果酒澄清效果的影响

2.3.2 硅藻土添加量对枳椇果酒澄清效果的影响

硅藻土是一种生物成因的硅质沉积岩，由于其结构的特殊性，赋予它强力的吸附性；同时，它还可以吸附部分的果胶、色素、酵母等其他固体悬浮物，从而达到澄清原酒的目的[23]。由图3可知，在硅藻土添加量范围内，透光呈先上升后下降再趋于稳定趋势，另外，黄酮质量浓度呈先上升后趋于稳定的趋势，硅藻土添加量0.2 g/L时，透光率达到最大值88.03%，黄酮质量浓度达到最大值为8.51 mg/L。因此，取硅藻土添加量0.2 g/L时，进行静置试验。

图3 硅藻土添加量对枳椇果酒澄清效果的影响

新发酵的酒，由于酒石酸盐沉淀、色素沉淀、金属破败、微生物混浊等[24]因素。澄清度变化较大，因此需要对澄清后的枳椇酒进一步检测其不同储存时间的透光度及黄酮质量浓度变化。由图4可知，将硅藻土添加量0.2 g/L的枳椇酒进行不同时间的静置处理，在静置时间1～5 d范围内，透光率缓慢下降，说明硅藻土能在较短的时间内达到最佳澄清效果，但可能还有生物与非生物因素的影响，影响枳椇酒的长期储存。另外，黄酮质量浓度呈先上升后减少再趋于稳定趋势，静置2 d时，枳椇果酒中黄酮质量浓度最高为9.63 mg/L。因此，最佳硅藻土添加量0.2 g/L、静置时间2 d，此时透光率为86.73%，黄酮质量浓度为9.63 mg/L。

图4 静置时间对枳椇果酒澄清的影响

2.3.3 皂土添加量对枳椇果酒澄清效果的影响

皂土吸水膨胀后形成胶体悬浮液，颗粒带负电，吸附酒液中带正电荷的蛋白质，形成絮状沉淀，从而使酒液澄清[23]。由图5可知，在皂土添加量范围内，透光率呈先上升后下降再趋于稳定趋势，皂土添加量4.0 g/L时，澄清效果达到最佳，透光率达到87.10%，添加量超过4.0 g/L时，透光率逐渐降低，可能是因为过量的皂土会导致下胶过量，引起酒体浑浊，同时影响酒体口感。另外，黄酮质量浓度呈先上升再趋于稳定趋势，添加量4.0 g/L时，黄酮质量浓度达到最大，为7.80 mg/L。因此，取皂土添加量4 g/L时，进行静置试验。

图5 皂土添加量对枳椇果酒澄清效果的影响

由图6可以知道，在静置时间1～5 d范围内，由透光率呈上升后下降趋势，静置2 d时，透光率达到最大值，为89.30%，之后缓慢下降，另外，黄酮质量浓度呈下降再缓慢回升趋势，两者可能是酒体依然存在稳定性不好的原因。因此，最佳皂土用量4 g/L、静置时间2 d，此时透光率达到89.30%，黄酮质量浓度为8.68 g/mL。

图6 静置时间对枳椇果酒澄清的影响

2.3.4 果胶酶添加量对枳椇果酒澄清效果的影响

果胶酶又称聚半乳糖醛酸水解酶，是分解果胶的一种复合物质，能够提高果蔬的出汁率、降低粘度，具有提高果汁、果酒澄清度的作用[25]，由图7可所示，在果胶酶添加量范围内，透光率呈先上升后缓慢下降的趋势，果胶酶添加量达到0.04 g/L时，透光率达到最大值85.20%，添加量超过0.04 g/L时，透光率呈缓慢下降趋势。可能是果胶酶添加量过多，酶蛋白又会使果汁产生混浊现象，造成透光率下降[25]。另外，黄酮质量浓度呈先上升后下降再趋于稳定趋势，果胶酶质量浓度0.04 g/L时，黄酮质量浓度达到最大8.92 mg/L，其后，黄酮质量浓度降低，可能是果胶酶过量添加，吸附了干浸出物，使黄酮质量浓度降低。因此，取果胶酶添加量0.04 g/L时，进行静置试验。

图7 果胶酶添加量的对枳椇果酒澄清效果的影响

由图8可知：在静置时间1～5 d范围内，透光率呈上升后下降趋势，静置2 d时，透光率达到最大值，为85.20%，与静置1 d时的透光率84.03%相差不大，可能需要充分的时间才能分解掉酒体中的果胶；2 d后的透光率的缓慢下降，可能是因为酒体没有足够的稳定性。另外，黄酮质量浓度呈下降再趋于稳定趋势，静置3 d时，达到最低值8.62 mg/L，之后酒体趋于稳定。因此，最佳果胶酶用量0.04 g/L、澄清时间1 d，此时透光率达到84.03%。黄酮质量浓度为10.92 mg/L。

图8 静置时间对枳椇果酒澄清的影响

2.3.5 壳聚糖添加量对枳椇果酒澄清效果的影响

壳聚糖是一种高分子聚合物，在微酸环境下，易被电子化，与氢离子、氨基结合形成带有正电荷的分子，赋予其较强的吸附性，是一种典型的阳离子型絮凝剂[26]。由图9可知，壳聚糖添加量范围内，透光率呈先上升后下降趋势。壳聚糖质量浓度0.4 g/L时，透光率达到最大值为90.23%，随着添加量继续增加，透光率减少，其原因可能是过量的壳聚糖会包裹微粒，影响架桥作用。与此同时，胶体表面还会产生二次吸附作用，影响澄清作用的持久性，吸附过多的有效成分，影响口感[26]。另外，黄酮质量浓度呈先上升后下降再趋于稳定趋势，壳聚糖添加量0.4 g/L时，黄酮质量浓度达到最大，为10.31 mg/L，因此，取壳聚糖质量浓度0.4 g/L时，进行静置试验。

图9 壳聚糖添加量对枳椇果酒澄清效果的影响

由图10可知：在静置时间1～5 d范围内时，透光率呈上升后下降趋势，静置2 d时，透光率达到最大值为91.00%，其后，透光率的下降可能是因为胶体表面还会产生二次吸附作用，进而影响微粒的稳定，影响澄清作用的持久性[26]；在静置时间1～5 d范围内，黄酮质量浓度先上升再下降后趋于稳定，在静置时间2 d时，达到最大值为10.02 mg/L，2 d后的下降可能是壳聚糖胶体充分地接触，在静置时间3 d时，达到最小值为8.24 mg/L。因此，最佳壳聚糖添加量0.4 g/L、澄清时间2 d，此时的透光率为91.00%，黄酮质量浓度为10.02 mg/L。

图1 芦丁标准曲线回归方程

图10 静置时间对枳椇果酒澄清的影响

2.4 正交试验优化复合澄清剂澄清枳椇果酒工艺条件

根据单因素试验结果综合分析，硅藻土、皂土、果胶酶和壳聚糖对枳椇酒的澄清有明显效果，其中壳聚糖透光率为91.0%，黄酮质量浓度为10.02 mg/L，澄清效果最佳；其次皂土透光率为89.30%，黄酮质量浓度为8.68 mg/L，透光率与澄清效果良好；硅藻土透光率为86.37%，黄酮质量浓度为9.63 mg/mL，澄清效果次之，但黄酮质量浓度较高；果胶酶透光率为84.03%，黄酮质量浓度为10.92 mg/mL，虽然黄酮质量浓度较高，但透光率较低，澄清效果相比一般；故选择硅藻土、皂土和壳聚糖三者为最终的复合澄清剂。同时结合静置试验，确定静置时间为2 d。

以透光率和黄酮质量浓度为指标，比较皂土、硅藻土和壳聚糖在最佳添加量下对枳椇果酒的澄清效果。由正交试验结果可以得出影响透光率的主次因素A＞C＞B，即皂土＞壳聚糖＞硅藻土，优水平为A3B1C1；同理，影响黄酮质量浓度的主次因素C＞B＞A，即壳聚糖＞硅藻土＞皂土，优水平为A2B1C2；由表3可知不同组合下，黄酮质量浓度的变化并不显著，因此，以透光率为主要指标，及A3B1C1组合为最佳试验组合，即皂土添加量6.0 g/L、壳聚糖添加量0.1 g/L、硅藻土添加量0.2 g/L。

表3 复合澄清剂澄清工艺优化正交试验结果与分析

2.5 验证性试验

对最佳处理条件A3B1C1进行重复性试验，以确定枳椇果酒澄清工艺的最佳方案。在复合澄清剂的处理下，取3次生物学重复，枳椇果酒透光率为92.60%，高于正交试验结果中最高透光率92.30%，其黄酮质量浓度为11.30 mg/L。

表2 澄清工艺优化正交试验因素与水平 单位：g/L

2.6 枳椇果酒的稳定性

果酒稳定性主要受生物稳定性与非生物稳定性的影响，生物稳定性主要包括蛋白质与微生物等有机成分的影响，非生物稳定性主要包括氧破败、铁破败、铜破败等影响[27]。取澄清工艺优化后的枳椇果酒的上清液做稳定性试验。

2.6.1 蛋白质稳定性

通过单宁-加热法试验观察，对比酒体前后的差异，有没有絮凝性沉淀。结果表明，澄清处理后的枳椇果酒没有产生沉淀，少量的蛋白质不足以发生蛋白质破败，其蛋白质的稳定性良好。

2.6.2 铁稳定性

果酒中的铁一般以还原态的形式存在，但Fe3+极易与果酒中的某些成分如色素，单宁，磷酸盐等结合产生不溶性沉淀[28]。结果表明，枳椇果酒没有出现浑浊现象，且测得铁含量为4 mg/L，果酒中铁含量低于8 mg/L时，果酒就不会发生铁破败病[29]，证明其铁稳定性良好。

2.6.3 铜稳定性

果酒中的铜易被还原成亚铜，形成难溶性化合物，在光照下亚硫酸将胱氨酸还原为半胱氨酸，然后半胱氨酸与铜生成不溶解的络合物。试验测得铜含量0.3 mg/L，小于0.8 mg/L，没有发生铜破败[29]，证明其铜稳定性良好。

2.6.4 氧化稳定性

放置24 h后的枳椇果酒与原枳椇果酒相比，色泽没有明显变化，亦没有出现沉淀以及浑浊的现象。同时测得枳椇果酒中游离的二氧化硫的含量为34.53 mg/L。质量浓度在30～50 mg/L[27]中，不会导致明显的铜破败和铁破败，所以枳椇果酒的氧化稳定性好。

2.6.5 生物稳定性

由于微生物对酒组成成分的代谢作用，会破坏酒的胶体平衡，导致酒体浑浊或沉淀生成[29]。在30 ℃恒温箱中放置10 d的酒样和原酒相比，没有发生浑浊现象，没有受到其他病菌的污染，说明枳椇果酒的生物稳定性较好。

3 结论

通过使用明胶、硅藻土、壳聚糖、果胶酶、皂土5种澄清剂对枳椇果酒进行澄清试验，以透光率和黄酮质量浓度为指标，同时对澄清后的枳椇果酒进行静置试验，筛选出3种对枳椇果酒澄清效果较好的澄清剂：皂土、硅藻土和壳聚糖。正交试验优化其配比后，复合澄清剂最佳配比为：皂土6 g/L，硅藻土0.1 g/L、壳聚糖0.4 g/L。通过验证性试验，证明在最佳复合澄清剂配比下，静置时间为2 d，其透光率达到92.6%，黄酮质量浓度为1.13 mg/L，整体优于单一澄清剂的澄清效果。

通过对处理后的枳椇果酒进行稳定性试验，澄清后的枳椇酒拥有有良好的稳定性。其中蛋白质稳定性与生物稳定性良好，没有絮凝性沉淀；同时，酒体中铁离子质量浓度为4.0 mg/L，铜离子质量浓度为0.3 mg/L，SO2质量浓度为34.53 mg/L，均在合理范围内，不会发生明显的铜破败与铁破败，氧化稳定性良好。此复合澄清剂整体澄清效果良好，澄清后的枳椇果酒稳定性高。由于澄清剂不同的澄清性质及酒类的不同，复合澄清剂的澄清效果总体要优于单一澄清剂，该试验为枳椇果酒的生产与加工奠定理论基础 。