芳香开窍药对血脑屏障通透性调控作用的研究进展

张志刚 范小璇 连露露 司泽钰 赵晓平 张毅 封玉宁 林隆杰

芳香开窍中药经常用于头昏、头晕等头部疾病的治疗,具有较好的效果。中医认为芳香开窍中药麝香、冰片、石菖蒲、苏合香和安息香具有芳香开窍、走窜、引药上行之性,可以循经入脑。血脑屏障(blood brain barrier,BBB)调控血液和脑组织之间的物质交换,维持了脑内部环境的稳定,但同时也阻碍了许多中枢神经系统药物进入脑内,使脑内药物的浓度难以达到有效浓度。现代药理学研究中发现芳香开窍中药可以调控血脑屏障通透性,保护中枢神经系统[1-2]。因此,对于芳香开窍中药治疗脑部疾病病是否与调控血脑屏障作用相关我们不得而知。本文以常见的芳香开窍中药麝香、冰片、石菖蒲、苏合香和安息香为代表,综述芳香开窍中药对血脑屏障通透性调控作用的研究进展,进一步了解该作用机制,为今后研究脑部疾病的治疗扩充思路,提供理论基础。

1 血脑屏障的调控影响

血脑屏障是由脑微血管内皮细胞、基膜、星形胶质细胞、周细胞及小胶质细胞共同组成的屏障结构[3]。调控血脑屏障通透性的因素主要以下几点:(1)脑血管内皮细胞间的紧密连接。生理状态下,内皮细胞结合处细胞间隙消失,当血脑屏障通透性增加时,紧密连接增宽,此方式主要是水溶性物质入脑的途经,这是因为紧密连接处存在的亲水性头状部分能够阻止脂溶性物质透过紧密连接[4]。(2)P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)。P-gp主要在上皮细胞顶膜、微血管内皮细胞和星型胶质细胞上表达,P-gp主动将脑组织产生毒性代谢物、异源性物质泵回血液,从而减少其脑内积聚,减轻毒副作用。P-gp转运体被认为是通过血脑屏障进行药物外排的主要载体,它将药物外排到血液中并减少药物在脑中的积累。(3)内皮细胞间隙。在细胞内外浓度差作用下,以被动扩散方式直接透过细胞间隙的孔穴进入脑内,该转运方式主要是针对一些脂溶性且分子直径小于孔径的物质。(4)内皮细胞上分布的特殊转运体,主要包括葡萄糖转运体、氨基酸转运体、核算转运体等,此转运方式主要运转一些必需物质,例如葡萄糖、氨基酸、核酸等。(5)特定受体介导的胞吞、胞饮作用,大多数内源性肽和蛋白质主要通过胞吞作用转运途径入脑;胞饮作用主要运转的是非正电荷非特异性的大分子物质[5-8]。

血脑屏障其他结构还有:基膜由层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、巢蛋白、硫酸肝素蛋白多糖和其他糖蛋白组成,分为内侧的血管基膜和外侧的薄壁组织膜;星形胶质细胞的足突结构牢固地围绕着脑微血管内皮细胞,正常情况下,这种足突结够不参与血脑屏障的屏障功能的执行[4]。目前众多研究表明,脑微血管内皮细胞在发挥屏障作用中占据主要地位,紧密连接是脑微血管内皮细胞间的重要结构[9]。

2 芳香开窍中药自身透过血脑屏障

2.1 麝香

麝香化学成分主要含麝香酮、麝香醇、麝香吡啶、睾酮、胆甾醇等,其中麝香酮是麝香的主要生理活性物质[10]。阅读文献发现关于麝香对血脑屏障的影响主要是麝香酮发挥作用。

麝香的化学成分麝香酮易透过血脑屏障直接进入脑内发挥作用。陈文垲等[11]实验研究报道,将麝香酮经大鼠尾静脉注射,以大鼠脑组织作为标本,测定其透过血脑屏障的脑内药物浓度,结果显示5分钟时脑中的麝香酮浓度已达到峰值,具有较高的浓度。李瑾翡等[12]通过灌胃方法给大鼠服用麝香酮,大鼠灌服麝香酮后1.5小时左右分别测血液和脑组织中麝香酮含量,发现脑组织的中的浓度达到最高。麝香酮自身易透过血脑屏障,且药物浓度在脑组织中下降较慢,蓄积时间较长。

2.2 冰片

冰片主要有天然冰片、艾片、合成冰片3种。汪宏锦等[13]研究表明,天然冰片、艾片、合成冰片的主要成分分别是右旋龙脑、左旋龙脑、异龙脑,它们对血脑屏障通透性的作用趋势一致。

冰片的主要成分是龙脑,冰片是小分子双环萜类化合物,小分子双环单萜的物质属性使得冰片能够容易透过BBB[14]。李伟荣等[15]实验研究,给予小鼠灌胃天然冰片,分别于给药后不同时间采用液相色谱分析法测量脑组织中冰片含量,结果显示灌服小鼠后5分钟即可在脑组织中测得,并且1小时左右浓度达到峰值,表明了冰片自身极易透过血脑屏障。

2.3 石菖蒲

石菖蒲的主要化学成分是挥发油,而发油中具有代表的活性成分是α-细辛醚、β-细辛醚、榄香烯等,这些活性成分对神经系统调节和治疗效果比较明显[16]。

石菖蒲主要的活性成分α-细辛醚、β-细辛醚自身易透过血脑屏障。Sheng M等[17]研究报道,石菖蒲主要活性主成分β-细辛醚可以顺利透过血脑屏障进入脑部组织。李晶[18]采用GC-MS联用技术,给大鼠灌胃给予石菖蒲挥发油后5分钟,即可在大鼠脑组织中检测到β-细辛醚和α-细辛醚的含量,说明石菖蒲挥发油中含有β-细辛醚和α-细辛醚,并且二者能够通过血脑屏障。

2.4 安息香

香脂酸类是安息香的主要挥发性成分,香脂酸类包括苯甲酸、肉桂酸、香草酸、苯甲酸松柏酯、苯甲酸苄酯、苯甲酸肉桂酯等[19]。

苯甲酸可以透过血脑屏障。黄立华[20]给予8只大鼠灌胃安息香药液,取灌胃大鼠脑组织并使用甲醇—乙腈萃取进行样本分析,在脑组织中检测到苯甲酸,这就证实苯甲酸透过血脑屏障进入脑组织中。

2.5 苏合香

苏合香主要有效化学成分为苯甲酸、苯甲酸苄酯、肉桂酸苄酯、肉桂酸肉桂酯等[21]。目前尚无实验直接证明苏合香中苯甲酸能够直接透过血脑屏障,但从安息香的化学成分作用来看,苏合香中苯甲酸也极其可能易透过血脑屏障。以后学者可进一步研究证实。

由此可见,芳香开窍中药的有效化学成分能够透过血脑屏障入脑,结合药物成分的性质及血脑屏障的结构功能来看,芳香开窍中药部分成分自身透过血脑屏障的作用机制可能与脂溶性物质易透过血脑屏障的特性有关,也可能与该成分作用于血脑屏障的结构从而打开其通透性有关,目前关于研究其透过血脑屏障的机制仍不明确。

3 芳香开窍中药增加血脑屏障通透性

3.1 麝香

麝香促血脑屏障开放与其有效成分麝香酮有很大关系,主要作用途径为:(1)麝香酮能够抑制Pgp在血脑屏障中的外排作用,降低血脑屏障外排系统将药物泵回血液中的效力,从而提高血脑屏障的通透性;(2)麝香酮可以抑制Claudin-5蛋白表达,以致使紧密连接的缝隙变宽、断续且结构减少,提高药物对血脑屏障的通透性。Wang Shixiang等[22]研究表明麝香的挥发油成分麝香酮通过对P-gp的外排转运抑制来改善血脑屏障的通。陈怡君等[23]通过成年斑马鱼注射麝香酮溶液试验,观察发现斑马鱼BBB超微结构在给药1小时后紧密连接结构疏松、内皮细胞出现皱缩,并检测BBB相关基因表达情况,发现Claudin-5基因的下调最明显,表明紧密连接结构变化可能与Claudin-5表达下调有关,从而增加血脑屏障通透性。赵庭鉴等[24]实验研究,将大鼠分为麝香酮组、冰片组、对照组、冰片加麝香酮组,分析比较发现麝香酮冰片组大鼠脑组织中的伊文思蓝含量及血液中神经生长因子含量均高于其他三组,表示麝香酮组指标的升高与麝香酮有关,表明麝香酮可以提高血脑屏障的通透性,促进其他物质透过血脑屏障。

3.2 冰片

冰片有效成分龙脑可通过增加五羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)含量、抑制P-gp外排作用、抑制Claudin-5蛋白表达来增加血脑屏障通透性。具体表现为:(1)通过增加脑微血管中5-HT的含量,提高5-HT受体与5-HT递质于脑血管内皮细胞膜上的结合率,引起内皮细胞强烈收缩,促使内皮细胞之间的紧密连接打开[25];(2)冰片有效成分龙脑可直接抑制P-gp的功能,减少对相应底物的外排作用[26],P-gp是存在于血脑屏障结构中的主动外向型转运体,依靠ATP水解释放的能量将大部分药物从脑组织中泵回血液,当龙脑抑制P-gp的外排功能后,使透过血脑屏障的药物在脑组织的含量增加。(3)Claudin-5蛋白在中枢神经系统的内皮细胞中高表达,一旦缺乏该基因,血脑屏障表现为选择性漏出[27]。因此,通过对Claudin-5蛋白表达的抑制,以致使紧密连接的缝隙变宽、断续且结构减少,提高药物对血脑屏障的通透性[28]。李伟荣等[29]给不同剂量组的大鼠灌胃冰片后,于不同时间点制备了大鼠下丘脑生物样本,测定各组脑中5-HT的含量,结果发现给药后各组5-HT含量较给药前均显著增高,该结果表明血脑屏障的开放可能与冰片成分介导5-HT含量增加有关。任赵燕[30]给小鼠5倍剂量组与等倍剂量组灌胃冰片后测定两组鼠脑组织中苯妥英钠、P-gp浓度,显示5倍剂量组小鼠脑组织中二者浓度比等倍剂量组高,推测冰片能够通增加脑组织中P-gp浓度,并通过抑制P-gp的外排作用增加血脑屏障的通透性。Jin等[31]发现给鼠灌胃合成冰片后,Claudin-5蛋白从脑毛细血管内皮细胞膜转移至细胞质,细胞间紧密连接缝隙变宽、断续、结构减少。

3.3 石菖蒲

石菖蒲有效成分β-细辛醚主要通过作用以下途径来加血脑屏障通透性。(1)β-细辛醚作用于脑微血管内皮细胞,促进微血管中分泌5-HT,提高5-HT受体与脑血管内皮细胞膜上的5-HT递质的结合率,引起内皮细胞强烈收缩,使内皮细胞之间的紧密连接增宽;(2)β-细辛醚可通过影响P-gp的外排功能,从而减弱其使药物从脑组织中泵回血液的能力,最终增加血脑屏障的通透性。(3)通过对Claudin-5蛋白表达的抑制,以致使紧密连接的缝隙变宽、断续且结构减少,提高药物对血脑屏障的通透性。刘超等研究发现灌喂石菖蒲药物组的小鼠脑内药物的浓度高于对照组,并且脑内5-HT的含量也显著高于对照组,提示其促进血脑屏障的开放机制可能是上调5-HT的含量来增加微血管上5-HT受体的结合率[32]。胡园等[33]实验研究推断石菖蒲可能是通过升高下丘脑5-HT含量从而开放血管内皮细胞间的紧密连接,最终改善血脑屏障的通透性。这些实验研究都表明了5-HT含量的增加最终促进了血脑屏障通透性的提高。王利苹等[34]研究以P-gp高表达的Caco细胞培养液中加入罗丹明-123为对照组,其中β-细辛醚孔细胞培养液中罗丹明-123的浓度较对照孔明显降低,因此β-细辛醚可降低细胞培养液中P-gp的底物罗丹明-123的浓度,推测β-细辛醚对P-gp外排功能有明显抑制作用。黄丽平等[35]研究发现石菖蒲挥发油有效成分β-细辛醚可明显减少Claudin-5、Occludin的表达水平,一定程度地提高血脑屏障通透性。

3.4 安息香、苏合香

阅读众多文献后发现,安息香与苏合香对血脑屏障通透性作用的机制基本等同,均与抑制P-gp在血脑屏障中的外排作用有关。通过抑制主动外向型转运体P-gp,减少对相应底物的外排作用,从而间接的提高血脑屏障的通透性。王利苹等[34]研究显示,在P-gp高表达的Caco细胞培养液中加入罗丹明-123 0.5小时和1.0小时后,安息香醛、香草醛孔细胞培养液中罗丹明-123的浓度较对照孔明显降低。提示苏合香、安息香主要成分安息香醛、香草醛可明显降低细胞培养液中P-gp的底物罗丹明-123的浓度,显示安息香醛、香草醛对P-gp外排功能有明显抑制作用。Wang Shixiang等[22]研究表明安息香挥发油成分可通过对P-gp的外排转运抑制来改善血脑屏障的通透性。在研究芳香开窍药自身易透过血脑屏障的物质时,文献报道安息香是苯甲酸,而在论述芳香开窍药促血脑屏障开放时,文献表明安息香发挥作用物质是香草醛,苏合香发挥作用的物质是安息香醛。因此对于苏合香及安息香发挥作用的化学成分具有进一步研究的价值。

4 芳香开窍中药降低血脑屏障通透性

在血脑屏障遭到破坏的病理状态下,易使氧自由基、炎症因子涌入,在细胞毒性脑水肿基础上继发血管源性脑水肿,芳香开窍药可降低血脑屏障的通透性,以致起保护中枢神经系统的作用[36]。中枢神经系统发生缺血再灌注、缺血缺氧时,脑内的星形胶质细胞及血管内皮能诱导产生释放一氧化氮、炎症因子、氧自由基、细胞因子及其一些血管活性物质等,作用于血脑屏障结构并对其进行破坏,从而使血脑屏障的通透性增加,导致有害成分趁此通过血脑屏障进入脑内,引起脑组织的进一步损伤[37]。研究发现,芳香开窍药能够作用于这些诱导释放的物质,从而减缓释放物质对血脑屏障的作用,降低血脑屏障通透性。

4.1 麝香

麝香有效成分麝香酮使血脑屏障通透性降低,发挥作用途径主要有以下2种:(1)通过降低炎症因子的含量、抑制基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinase,MMP)的表达从而稳定血脑屏障的正常结构,以达到对血脑屏障通透性的降低。病理状态时,星形胶质细胞和血管内皮细胞迅速激活、增殖并分泌大量炎症因子,入如白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等,可以对毛细血管产生直接毒性作用,导致内皮细胞间的紧密连接破损。生理条件下以无活性的酶原形式存在的MMP,在炎性介质作用下会转化为以活性成分存在,可以降解毛细血管基底膜一些基质蛋白,引起血脑屏障结构和功能破坏,其中表现作用最明显的是明胶酶B[38-40]。(2)在发挥抗自由基损伤作用时,可以减轻自由基引起的细胞损伤,削减自由基引起的血脑屏障通透性增加作用,从而降低血脑屏障的通透性。在脑缺血缺氧过程中会产生大量的自由基,例如O2-、NO2-、OH-等。过量的自由基会导致脂质、蛋白质及核酸过氧化,从而导致血管内皮细胞损伤,破坏血脑屏障的完整性引起脑损伤[40]。氧自由基可通过作用于不饱和脂肪酸来诱导脂质过氧化,形成脂质过氧化物如丙二醛(malondialdehyde,MDA),同时降低超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,因此,组织中MDA水平和SOD活性可以反映自由基对细胞的损害程度[41]。

徐秋英等[42]研究在缺血再灌注损伤的大鼠模型中给予人工麝香溶液治疗24小时后,检测脑组织中MMP-9的表达,与模型组相比人工麝香药物组的MMP-9的表达均较低,显示麝香可抑制缺血再灌注大鼠脑组织中MMP-9的表达,从而降低脑组织血脑屏障基底膜细胞外基质的降解和血脑屏障的通透性。其在另一个实验中发现了冰片、麝香能显著下调IL-1β、IL-6的含量,减弱炎症因子对血管外基膜及血脑屏障紧密连接的降解破坏作用,降低血脑屏障通透性[43]。当麝香酮发挥抵抗自由基损伤作用时,脑组织中MDA水平下降、SOD活性增加。孙蓉等[44]研究显示在大鼠完全性脑缺血后再灌注期间,麝香的挥发油麝香酮可明显增加脑组织中的SOD含量,降低MDA含量,保护血脑屏障,进而保护脑组织。冰片通过上调SOD活性、下调髓过氧化物酶活性,保护血脑屏障以防炎症因子通过血脑屏障进入脑组织发生炎症反应进而导致神经损伤的发生[45]。

4.2 冰片

冰片有效成分龙脑可通过调节诱导性一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)水平、对抗炎性反应等2方面来降低血脑屏障通透性。(1)在病理状态下,内皮组织细胞表达iNOS并产生大量的NO,从而破坏血脑屏障以致增加其通透性。龙脑作用于内皮组织细胞,抑制iNOS的表达,减弱其合成NO的能力,降低NO水平,从而降低血脑屏障通透性。(2)通过降低炎症因子的含量,减弱其对毛细血管产生的毒性作用,降低内皮细胞间的紧密连接破损程度;还可抑制MMP的表达,使毛细血管基底膜完整,避免引起血脑屏障结构和功能破坏。

病理状态下,龙脑对脑微血管内皮细胞内iNOS表达明显减弱,降低血脑屏障的通透性以保护脑组织[34]。Liu等[46]实验研究发现冰片可降低缺血再灌注大鼠脑内iNOS的表达。文献表明冰片可以使基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的表达下调,调节血脑屏障的通透性,得以起到脑保护的作用[47]。倪彩霞等[48]通过开窍药物组大鼠血清中TNF-α含量与模型组相比较,得出冰片挥发成分龙脑组对降低血清中TNF-α的作用较模型组强,推测龙脑对抗血脑屏障通透性增大的机制与其抗炎症反应有关。亦有实验发现冰片能下调IL-1β、IL-6的含量,减弱炎症因子对血管外基膜及紧密连接的降解破坏作用,表现出保护血脑屏障结构、降低血脑屏障通透性的作用[43]。

4.3 石菖蒲

石菖蒲能够发挥抗自由基损伤作用,减轻自由基引起的内皮细胞损伤,保护血脑屏障的完整性,从而降低血脑屏障的通透性。石菖蒲可以降低MDA含量、增加SOD活性,抵抗β-淀粉肽25-35诱导的海马神经元自由基损伤,减轻因自由基损伤导致对血管内皮细胞的破坏,保护血脑屏障的完整性以降低其通透性[34]。目前研究在病理状态下石菖蒲对血脑屏障通透性作用的文章较少,对其发挥作用的具体成分还难以确定,待进一步研究。

4.4 安息香、苏合香

通过降低炎症因子的含量,减轻其对内皮细胞间的紧密连接破损,从而对抗血脑屏障通透性的增大。倪彩霞等[48]测定开窍药物组大鼠血清中TNF-α含量与模型组比较,显示冰片、麝香对降低血清中TNF-α的作用最强,苏合香、安息香的作用较弱,因此苏合香及安息香也可以对抗炎性反应,降低血脑屏障通透性。目前该两味药的研究也较少,因此还不能够研究出安息香及苏合香对抗炎性反应时发挥作用的具体成分。

5 总结与展望

综上,芳香开窍药不仅自身可透过血脑屏障,并且对血脑屏障通透性具有双向调控作用。芳香开窍药提高神经递质5-HT含量,提高递质与受体结合率,也可以抑制claudin表达,最终促进微血管内皮细胞紧密连接增宽打开,还可抑制P-gp外排功能,减弱将进入脑组织药物泵出,通过以上几个主要方面表显出提高血脑屏障通透性增加的作用。在脑组织受伤损伤,例如缺血缺氧等病理状态下,病理产物导致血脑屏障的结构破坏,使通透性较生理状态增高,此时给予芳香开窍中药,可通调节iNOS水平、抗炎减少炎症因子含量、抗自由基损伤来维护血脑屏障结构,阻止血脑屏障通透性的病理性增高。

近些年实验研究芳香开窍中药对血脑屏障作用的文章较少,对每味药影响血脑屏障通透性系统、深入的研究较少,缺乏研究开窍药物对血脑屏障通透性的机制和作用靶点。由于目前对麝香、冰片、石菖蒲研究较多,而对苏合香、安息香的研究资料较少,因此本文还不能够更加全面、充分地认识芳香开窍类药物对血脑屏障的作用机制。结合目前研究现状及临床困难,研究药物对血脑屏障的通透性的作用具有很大价值,从祖国医学角度出发,在中药中寻找改善药物透过血脑屏障的方法,对今后治疗脑部疾病有非常重要的意义。