高效液相色谱法测定复配消毒凝胶中的葡萄糖酸氯己定

张柯，胡巅

(河南省疾病预防控制中心，河南 郑州 450016)

氯己定属于双胍类高效广谱消毒杀菌剂，其为阳离子表面活性剂，具有强的广谱抑菌、杀菌作用，尤其对革兰阳性和阴性菌的抗菌，广泛应用于皮肤黏膜的消毒[1]。目前，氯己定单方制剂使用较少，常与其他消毒剂复配使用，复配成分有羟苯酯、季铵盐和中成药等[2]。氯己定复配后成分复杂，难以控制消毒剂的质量，因而需要建立准确可靠的分析方法。

传统检测氯己定的方法有滴定法[3]和分光光度法[4-5]。高效液相色谱法采用先分离后测定的模式，近年来已经成为氯己定消毒剂测定的首选方法，目前主要应用于醋酸氯己定消毒剂的分离与含量测定。杨宁辉等[6]以乙醇-乙酸水溶液为溶剂，超声提取样品中的醋酸氯己定和苯扎氯铵。采用Symmetry C18色谱柱，乙腈-丁烷磺酸钠水溶液流动相，260 nm波长测定复配消毒软膏中醋酸氯己定和苯扎氯铵。建立的离子对液相色谱法能够准确灵敏地测定复配消毒软膏中醋酸氯己定和苯扎氯铵的含量，该方法线性范围宽、选择性强，具有良好的准确度和精密度。夏方亮[7]采用C18柱为固定相，以甲醇-水-三乙胺(65∶35∶0.3，含0.01 mol·L-1庚烷磺酸钠，用磷酸调节pH 4.0)为流动相，建立高效液相色谱法测定醋酸氯己定碘醇溶液中醋酸氯己定的含量测定方法。上述研究方法在流动相中加入了离子对试剂，增加了保留时间和改善色谱峰型，缺点是离子对试剂在色谱仪中易残留，影响色谱柱和检测器寿命。彭贤东等[8]采用Atlantis C18柱，流动相为乙酸铵-甲醇，建立准确可靠的高效液相色谱法同时测定复方水杨酸硫乳膏中水杨酸和醋酸氯己定的含量，分离效果良好。与醋酸氯己定相比，葡萄糖酸氯己定具有水溶性好、刺激性小的优点，市场上逐渐代替传统的醋酸氯己定，应用范围和市场占比逐年扩大，但其检测方法的研究目前较少[9-10]。建立复配消毒剂中葡萄糖酸氯己定准确可靠的检测方法，对评价产品质量、开发新型产品具有重要的意义，本文通过优化高效液相色谱流动相条件，以醋酸铵-醋酸缓冲液(0.02 mol·L-1，pH=4.0，加入体积分数为5‰的三氯乙酸)和乙腈为流动相，建立复配消毒剂中葡萄糖酸氯己定含量的测定方法，研究报告如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂高效液相色谱仪(LC-20，岛津公司)、电子天平(赛多利斯公司，型号BSA224S)、超声波清洗仪(Elma公司，型号P30H)、pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司，型号PHS-25)、恒温水浴锅(上海跃进医疗器械有限公司，型号HSY)。葡萄糖酸氯己定(Sigma-Aldrich公司)，乙腈(色谱纯，阿拉丁公司)，乙醇、三氟乙酸、醋酸盐缓冲盐均购自国药集团，实验用水为石英亚沸蒸馏水(自制)。

1.2 仪器条件Waters XBridge C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相A为醋酸铵-醋酸缓冲液(0.02 mol·L-1，pH=4.0，加入体积分数为5‰的三氯乙酸)，流动相B为乙腈，等度洗脱(A+B=80+20)；柱温30 ℃；进样量10 μL；流速1.0 mL·min-1；二极管阵列检测器波长258 nm。

1.3 标准系列电子天平精密称到葡萄糖酸氯己定标准溶液1.00 g，去离子水定容于10.0 mL容量瓶中，摇匀后得到质量浓度为20.0 g·L-1的标准品储备液。移液枪分别吸取上述适量对照品标准储备液于100 mL容量瓶中，去离子水定容。配制浓度为5.0 、20.0、50.0、100.0、200.0和500.0 mg·L-1的标准使用液。

1.4 样品的测定精密称取1.0 g葡萄糖酸氯己定复合消毒剂产品于100 mL容量瓶中，加入80.0 mL体积分数为80%的酒精，醋酸调节pH为4.0，在水浴锅中50 ℃超声提取10 min，冷却到室温后，采用体积分数为80%的酒精水溶液定容，过0.45 μm滤膜后上机测试。

2 结果

2.1 专属性实验按1.2部分设置色谱仪器条件，配制标准品上机测试，葡萄糖酸氯己定标准品的色谱图和紫外可见吸收光谱如图1所示，葡萄糖酸氯己定标准品的保留时间为3.128 min，标准品色谱图中无其他杂质峰出现，紫外可见吸收光谱的最大特征吸收特征波长为258 nm。

样品处理后上机测试，其液相色谱图和紫外可见吸收光谱如图2所示，样品中葡萄糖酸氯己定的保留时间为3.227 min，与图1标准品的保留时间基本一致，两者保留时间的相对偏差<5%。样品中待测物和杂质的分离度良好(R>1.5)，杂质基本不干扰葡萄糖酸氯己定的测定。通过比较标准品与样品的吸收光谱，进一步做定性鉴别，样品中葡萄糖酸氯己定的吸收光谱与标准品的吸收光谱图的轮廓基本一致，其最大特征吸收波长均为258 nm。样品的紫外可见吸收光谱显示，葡萄糖酸氯己定峰的纯度>99%，无其他杂质吸收峰的干扰，检测方法的专属性良好。

2.2 流动相的优化反相液相色谱中，流动相的选择对分离起到至关重要的作用，流动相的种类和组成影响待测组分在色谱柱上的保留时间和色谱峰的峰形，如图3所示，采用磷酸缓冲液(体积分数为70%)-乙腈(体积分数为30%)为流动相时，葡萄糖酸氯己定的色谱峰较宽，基线噪声较高，并且色谱峰有明显的拖尾现象。

葡萄糖酸氯己定在水中解离出阳离子，目前的检测方法是加入离子对试剂，但会造成色谱柱的操作。实验采用添加了5‰三氟乙酸的醋酸盐缓冲液(80%)-乙腈(20%)为流动相来优化流动相条件，葡萄糖酸氯己定的色谱峰如图1所示，色谱峰型正态分布，对称性良好，半峰宽较窄，无色谱峰前展和拖尾现象。

2.3 检测限与定量限在空白样品中加入的标准溶液，样品中葡萄糖酸氯己定的质量浓度为10 mg·L-1。按照1.2设定的仪器条件，进样后记录色谱峰高和基线的噪声，将样品逐级稀释，当信噪比(S/N)为3时确定为方法的检测限，S/N为10时定为方法的定量限。重复测定3次，得到仪器的噪声和测定的平均结果，计算出方法检测限为0.5 mg·L-1，方法定量限为2.0 mg·L-1。

2.4 校正曲线在1.2的仪器条件下进样标准系列，记录各个标准点的色谱图峰面积。以葡萄糖酸氯己定的质量浓度为横坐标，相应的色谱峰面积为纵坐标，作线性回归曲图，最小二乘法线性拟合并回归分析，得到葡萄糖酸氯己定的工作曲线。当葡萄糖酸氯己定质量浓度在5～500 mg·L-1时，拟合曲线的线性关系良好，工作曲线的回归方程为y=17 856.2.3x+3 564.5，拟合的相关系数r等于0.999 4。

2.5 样品的检测准确称量2种市售复合葡萄糖酸氯己定样品，按照1.4部分处理样品后，将样品中葡萄糖酸氯己定稀释到标准曲线线性范围，经0.45 μm直径滤膜过滤后上机测定。将样品与标准品的色谱保留时间和PDA检测器光谱图进行对比，对样品中存在的葡萄糖酸氯己定进行定性分析，标准曲线法定量，检测结果见如表1，2种样品中葡萄糖酸氯己定的含量分别为0.57%和0.48%，平行测定偏差在允许差范围内，样品中葡萄糖酸氯己定含量在厂家标识范围内，该产品中葡萄糖酸氯己定含量合格。

2.6 准确度和精密度配制合适浓度的样品溶液，在优化的仪器条件下，连续进样7针样品溶液，记录葡萄糖酸氯己定的峰面积，计算7针色谱峰面积的相对标准偏差，考察色谱条件的系统适用性，实验结果表明，连续进样7针时葡萄糖酸氯己定标准品的峰面积的相对标准偏差值(n=7)为4.2%，色谱峰保留时间的相对标准偏差值(n=7)小于0.2%，检测方法的重现性良好。

按照所设定的样品前处理方法和优化的色谱条件分别测试样品，计算样品中葡萄糖酸氯己定的含量为0.48%。采用样品加标实验来验证方法的准确度，样品加标分为低、中和高3个水平加标，其中低水平加标为样品含量的一半，中水平加标为样品含量，高水平加标为样品含量的2倍，考察不同含量下的加标回收率，评价方法的准确性。将加标后样品提取液稀释到标准曲线范围内，由标准曲线得到加标后溶液含量，计算样品加标回收率和平均加标回收率。如表2所示，样品加标回收率为92.5%～101.3%，该检测方法的准确性较好。

3 讨论

常用的氯己定类消毒剂有盐酸氯己定、醋酸氯己定和葡萄糖酸氯己定，其中盐酸氯己定和醋酸氯己定在水中的溶解度较小(<2%)，而葡萄糖酸氯己定的水溶解好(20%)，适合与其他水溶性消毒剂复配，形成复合溶液、膏体和凝胶等多组分剂型。复配消毒剂可作为杀菌消毒剂，用于医疗器械和皮肤的消毒剂，具有毒性低、刺激性小等优点。《消毒技术规范2002》采用磷酸缓冲盐和乙腈为流动相检测醋酸氯己定，乘以换算系数计算葡萄糖酸氯己定，但由于葡萄糖酸氯己定溶解度与醋酸氯己定差异较大，其样品前处理和色谱保留性能与醋酸氯己定有所差异，葡萄糖酸氯己定测定方法还有待于深入开展。鉴于葡萄糖酸氯己定逐渐取代醋酸氯己定的国内外发展趋势，研究葡萄糖酸氯己定的样品提取和准确可靠的测定方法，对加强葡萄糖酸氯己定的产品质量控制有着重要的应用价值。

葡萄糖酸氯己定在溶剂中离解为氯己定阳离子和葡萄糖酸阴离子，氯己定阳离子与C8色谱柱固定相上的残存硅醇基产生静电作用，影响色谱分离性能，造成色谱峰严重拖尾、保留时间重现性差等现象。采用离子对色谱法可以提高离子型化合物的分离系数，改善分离效果。烷基磺酸钠是广泛应用于反相离子对色谱的阴离子对试剂，但离子对试剂对色谱系统的性能影响较大，若冲洗不及时和完全会造成色谱柱寿命的缩短和检测器的老化。本研究采用醋酸铵为流动相，加入三氟乙酸溶剂改良剂，替代离子对试剂的功能，醋酸盐解离出的醋酸根阴离子，三氟乙酸解离的F离子，均能够与氯己定阳离子形成中性离子对，改善氯己定在C18色谱柱上的保留性能，减小使用表面活性剂离子对试剂所造成的色谱柱和检测器使用寿命的损失，增强检测方法的适用性。

单纯的氯己定属于低效消毒剂，但与乙醇等其他消毒成分复合后，能够产生协同增加作用，达到中效消毒剂水平。葡萄糖酸氯己定与其他消毒剂复合后，能够扩大消毒剂的使用范围和作用效果，扩展其使用范围。但复配后消毒剂的基质成分变得更为复杂，对分析检测的方法提出更高的要求，需要选择更为合适的仪器条件。二极管阵列检测器光谱扫描结果发现，葡萄糖酸氯己定在205、231和258 nm处有吸收，其中波长258 nm为最大特征紫外可见吸收波长。相比较205 nm和228 nm，采用258 nm波长检测时的背景吸收较小，实验选择258 nm作为葡萄糖酸氯己定的测定波长，在该检测波长下，消毒剂中其他成分并不干扰测定，方法的专属性良好。通过优化色谱流速，柱温和流动相比，建立了葡萄糖酸氯己定含量测定的色谱法，该方法应用于复配凝胶消毒剂中葡萄糖酸氯己定的测定，效果令人满意。