高眼压动物模型的研究进展

刘科琳 王英 李君一 徐韶琳

(吉林大学第二医院眼科中心青光眼科 长春 130041)

青光眼是一组威胁和损害视神经及视觉通路，导致视觉功能损害的疾病，病变造成的进行性视神经萎缩不可逆转，给患者生活质量造成很大影响。对于40~80岁的人群，青光眼的全球患病率为3.54%[1]；在亚洲，原发性闭角型青光眼患病率最高，达1.09%[2]，致盲率达10%。其发病机制尚未阐明，眼压升高是其危险因素。在研究青光眼的损伤机制和发展过程中，实验动物模型的建立必不可少。目前比较常用的动物有兔、猴、鼠等，猴眼与兔眼二者体积相对较大，操作容易，易于在实验中观察眼底；但是成本高，猴更是价格昂贵，而兔常出现眼内炎症，对实验研究皆是一种限制[3]。啮齿动物鼠模型是优选的模型之一，因为鼠的寿命较短且成本较低；此外啮齿类动物在与人的眼部解剖结构上有许多相似之处，比如有类似的小梁网结构、发达的睫状肌以及类似的房水流出途径和房水动力学[4]；并且啮齿类动物高眼压模型的表现与人类青光眼疾病特征具有一定的相似性，如高眼压所导致的视网膜神经节细胞(retinal ganglial cell，RGC)和视神经的损害[5]。本文就青光眼高眼压模型的发展做一概括，从操作诱导模型和转基因模型2个方面对国内外学者研究的常用青光眼高眼压模型进行总结，分析其利弊，为以后研究选择实验动物模型提供参考和依据。

1 操作诱导模型

现有高眼压模型的建立多以阻滞房水循环为基础达到增高眼压的目的，通过影响小梁网组织或改变巩膜上静脉压力进而影响房水流出途径。常见操作诱导法分为前房阻塞法、药物诱导法及机械损伤法。

1.1 前房阻塞法

1.1.1 自体血细胞前房阻塞法 1980年报道记录Quigley和Addicks使用自体固定红细胞建立实验灵长类动物慢性眼压升高模型。该模型通过裂解离心等一系列操作溶出新鲜血细胞中的血红蛋白，形成固定的血影细胞(ghost blood cell，GBC)。这种失去了大部分或全部血红蛋白的GBC，残留的包膜较硬，进入前房后，难以离开小梁网孔，进而阻塞小梁网影响房水循环引起高眼压。镜下显示，小梁网内有大量的变形GBC。该模型的优点是容易产生眼压升高，并且少有相关的眼内炎症，而为使眼压增高，需要广泛大量填充前房，导致模型具有眼底视盘可视度差的缺点[6]。

1.1.2 微珠前房阻塞法 小梁网细胞是活跃的吞噬细胞，其功能可能是使引流途径不受细胞碎片、色素和其他物质的影响。微珠注入眼前段，部分可被小梁网细胞吞噬，阻碍房水的流出[7]。随着研究的深入，微珠注射开始应用于高眼压模型制备。2001年Weber等[8]报道一种灵长类动物实验性青光眼模型，通过向雌性恒河猴的眼前房注射直径10 μm无菌乳胶微珠，诱导非人灵长类动物眼内压升高模型。乳胶微珠主要通过限制房水通过小梁网流出来产生高眼压，操作过程无须昂贵的眼科设备和人员及手术干预。乳胶微珠阻塞相对于自体血细胞注射而言，提高了视盘的可见性。考虑到体外异物会引起眼内炎症问题，乳胶微珠常通过γ辐射进行彻底清洗灭菌[9]。但是微珠小梁网阻塞法依然具有局限性，微珠眼前段注射后可能难以长久保留，从而导致眼压的变化增大，珠子在前房内的位置也无法很好控制。如果微珠悬浮于瞳孔区域，它们依旧会影响检眼镜观察眼底的视野。后续此类模型不断改进，Samsel等[10]提出了一种利用磁性微珠诱导高眼压的新技术。磁珠的优点是通过使用磁性微珠和手持磁铁，可以降低注射后的磁珠回流并改善前房中的磁珠分布，将它们注入啮齿动物眼中的虹膜角膜角，增强小梁网的闭塞并促进眼底的可视化。可以根据需要进行后续注射，以进一步调节眼压的升高，为实验性青光眼的诱导提供了一种简单、有效的方法。也有研究[11]将微珠与黏弹性溶液混合注入前房，此种模型相对于单纯注射微珠可以建立实现更持久的眼压升高。2019年Biswas等[4]总结了前人所做的在重复注射或不重复注射的情况下，在大鼠和小鼠身上使用不同尺寸、体积和浓度的微珠来建立青光眼模型。总之，微珠前房阻塞法具有方法简单，实验动物易耐受的优点，但微球可能阻塞瞳孔影响进一步观察是其劣势[12]。

1.1.3 凝胶前房阻塞法 有研究[13-14]发现兔、猴和人眼中具有糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)谱，即透明质酸(hyaluronic acid，HA)、硫酸角质素(keratan surfate，KS)、硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素-硫酸软骨素杂化，特别是小梁GAG与流出阻力的调节以及青光眼的发展有关。人眼小梁网中GAG的强烈组织化学染色表明，在流出途径中存在大量的HA[15]，定量分析表明它是人眼小梁网中含量最丰富的GAG[14]。Benozzi等[16]通过向大鼠前房注射HA肯定了其对眼压的影响，但并未解决是否存在视神经及视网膜病变。后Moreno等[17]通过建立同样模型对比发现，实验引起的视网膜改变与其他青光眼实验模型中观察到的变化类似，提出HA前房注射可能是一种新的大鼠青光眼高眼压模型。近些年提出几种HA为骨架的改良生物基质[18-19]制备高眼压模型，与HA相比具有一定优化性。2002年徐岩等[20]首次报道了以复方卡波姆为诱发高眼压模型材料的研究,肯定了该模型的可行性与实用性。之后，应用此种高眼压模型进行青光眼相关病理的研究逐渐增多。凝胶前房阻塞法既有优越性又有不足，凝胶成本较低，操作方便，无须精细技术；但复方卡波姆pH较低值，可能会引起炎症反应。

1.2 前房灌注法 前房生理盐水灌注法是通过将输液针头连接到无菌生理盐水瓶上，然后将针头刺入实验动物前房，将输液瓶提升至高于眼睛水平面150 cm的高度，这一高度可以使实验动物眼压升高至110 mmHg(1mmHg=0.133kPa)，是一种常见的急性高眼压模型建造方法，解剖上观察可发现急性高眼压引起的轴突变性、RGCs明显丢失等一系列典型表现[21]。此模型病理生理上也称为缺血-再灌注损伤模型，具有操作方便，眼压升高幅度可控的优点，可以通过调整灌注液的高度准确制作出不同病变损伤程度的缺血模型。该方法可适用于鼠、兔等多种实验动物用来制作稳定、易得的急性高眼压动物模型[22]。

1.3 药物诱导法 糖皮质激素(简称激素)诱导法。全身或局部应用激素在一定程度上抑制人眼小梁网细胞吞噬作用，增加房水流出阻力，升高眼内压，导致继发性青光眼[23]。激素可以调节各种细胞外基质(etracellular matrix，ECM)蛋白的表达和分泌，暴露于地塞米松的人小梁网细胞显示层粘连蛋白、纤连蛋白等蛋白表达增加，这些蛋白可能会聚集在小梁网中，进而阻止房水流出。地塞米松还可能影响调节ECM转换蛋白水解酶的表达，包括基质金属蛋白酶和组织纤溶酶原激活剂，导致小梁网组织中ECM物质的堆积，进而房水流出阻力增加，眼压升高[24]。激素诱发高眼压已经在多种实验动物模型中得到证实[25-28]。2014年Zode等[29]通过小鼠局部眼睛滴用地塞米松诱导高眼压小鼠模型，观察到慢性地塞米松治疗导致小鼠RCG结构和功能丧失以及视神经变性，与激素诱发的青光眼患者相似。除上述的外用眼部滴用激素，也有研究[30]选择全身应用激素检测眼压变化，但是全身应用激素的影响，使得一些实验动物无法存活。此类模型操作简单，具有很大的潜在价值，但是容易引起激素并发症，建造此类青光眼模型时，实验动物的选择比较重要。

1.4 机械损伤法

1.4.1 巩膜外静脉烙闭或结扎法 巩膜上静脉烧灼术(episcleral vein cauterization，EVC)又称Shareef模型，是目前青光眼模型中比较成熟、使用较多的一种。Shareef等[31]以大鼠为实验动物，通过烧灼烙闭2条或以上巩膜上静脉影响房水流出来模拟青光眼高眼压模型，烧灼后观察可见巩膜上静脉立即充血，眼压明显升高，并能维持较长时间。病变特点与临床开角型青光眼相似[32]。模型不断被发展，猪[33]、兔[34]也成为此种模型的实验对象。考虑到巩膜上静脉烧灼具有一定难度，可能会对巩膜造成损害，Yu等[35]以大鼠为实验动物，通过巩膜上静脉结扎术，建立同样阻塞巩膜上静脉血流，达到眼压升高、视网膜视神经病变为目的的青光眼高眼压模型。其缺点在于即使非常小心地避免巩膜受损，烧灼手术有时也会对周围的眼睛组织或巩膜造成伤害，并伴有诸如眼内炎症或眼表损伤之类的眼部并发症[36]。

1.4.2 激光光凝法 1974年首次报告一种以恒河猴为实验对象的高眼压模型，该模型通过氩激光光凝恒河猴前房角小梁网，造成房水流出能力降低，从而形成高眼压，观察发现小梁及其周围组织瘢痕形成伴Schlemm管闭塞[37]。之后也出现以同样方法制备兔青光眼高眼压模型的研究[38]。此类模型在当时条件的限制下，对于体型较小的啮齿类动物，常因前房角太窄等原因致使光凝时无法精确对准小梁网。日本学者[39]设计研究一种通过激光光凝选择性燃烧啮齿动物小梁网的方法，以大鼠为实验模型，通过前房注射印度墨汁，3~7 d后，房水循环可将碳颗粒沉积在小梁网中，沿角膜缘形成约0.2 mm宽的黑带，为后续激光光凝小梁网提供直观的操作部位，也因此成功建立了激光技术啮齿类动物青光眼高眼压模型。之后也有研究[40]通过前房注射吲哚菁绿染料和半导体激光联合治疗，证实激光烧灼吲哚菁绿预处理眼是一种成功诱导小鼠慢性高眼压模型的方法。激光光凝小梁网建立实验动物高眼压模型从尝试到改进发展，其操作技术已经逐渐成熟。激光光凝是一种完全非侵入性建模方法，实验动物眼压升高迅速并且维持时间长，但是所需设备昂贵，操作相对复杂，激光对小梁网的破坏较彻底并且不可逆，实验中可能会出现眼压不稳定或不可逆瞳孔散大等问题[12]。

2 基因诱导模型

遗传学研究一直是了解导致疾病或改变疾病易感性的基因和病理机制的有力手段。近些年，青光眼的分子基础取得重要进展，人类基因研究的证据表明，MYOC中的显性遗传突变会导致原发性开角型青光眼[41]。1998年有研究记录DBA/2J品系小鼠眼前段异常的发展，最早在3~4个月可发现小鼠眼周边虹膜透光性缺陷、色素弥散以及瞳孔边缘因局部聚集充满色素的巨噬细胞而导致的虹膜增厚，并随着时间的推移变得更加严重。这些异常导致眼压升高继而形成人类所谓的青光眼，病理变化过程中伴随着与青光眼相一致的视网膜和视神经改变，证实了使用该小鼠品系来评估影响青光眼细胞死亡的机制和确定改变青光眼神经损伤易感性的基因是可行的[42]。后DBA/2J小鼠纯系被用作慢性闭角型青光眼的啮齿动物模型[43]。Anderson等[44]在报道中描述了AKXD28小鼠品系，AKXD28是由DBA/2J和AKR/J品系小鼠杂交产生的重组近交系，研究显示AKXD28小鼠患上与年龄相关的青光眼，包括眼压升高和视神经损伤表现；更重要的是，虽然DBA/2J和AKXD28品系小鼠实验中表现出相似程度的眼压，但AKXD28小鼠的视网膜损伤比DBA/2J小鼠更严重、更广泛，这表明与DBA/2J小鼠相比，AKXD28小鼠对压力诱导的损伤具有更高的遗传易感性。这2种品系小鼠均可作为慢性高眼压模型使用。但尚无可用于急性和间歇性/亚急性闭角型青光眼的遗传性动物模型，近些年Ittner等[45]首次提出一种新的转基因小鼠高眼压模型，与DBA/2J小鼠不同，报告提出的CLR转基因小鼠在1~3个月时可出现急性眼压增高，可作为一种新的自发性急性高眼压模型。转基因及基因打靶制备青光眼模型目前正在蓬勃发展中，无论是制备高眼压模型或是非高眼压模型，较多研究者已开始进行实验，此类模型仍待更进一步探索与了解。

3 结语

青光眼模型的制备方法有很多，制备模型可选择的实验动物亦有多种。本文仅从高眼压模型这一个角度描述了近些年常用的青光眼高眼压模型的研究进展，无论是操作诱导模型还是转基因模型都各有利弊，实验者在具体研究中应根据实验目的选择合适的造模方法。传统的诱导操作模型前人积累的经验较多，为后来的实验进行提供更多的选择；正在蓬勃发展、有待更深探索的转基因模型虽然了解不够全面，但是未来随着对青光眼分子机制的了解，转基因模型的制备具有很大的研究前景。