PEG 渗透胁迫条件下26 份花生品种萌发期抗旱性评价

杨秀丽,宁东贤,赵玉坤,杨丽萍,李 楠

(山西农业大学小麦研究所,临汾 041000)

我国是世界上最干旱的国家之一,干旱半干旱面积占国土面积的52.5%,干旱缺水是我国农业生产面临的严重问题,干旱胁迫给农作物带来的损失远大于其他所有逆境损失的总和[1]。 花生(Arachis hypogaeaL.)是较耐旱耐贫瘠的油料和经济作物之一,也是发展旱作农业、充分开发利用旱薄地资源的理想大田作物。 在国内农作物中,花生种植业年产值已超过1 000 亿元人民币,居第4 位,排在玉米、水稻、小麦之后,与大宗粮油作物相比,花生初级产品价格较高,单位面积收益率高,可给农民带来更多的经济效益[2]。 然而,干旱依然成为花生生产上危害程度较大的逆境因素之一,可引起花生品质下降,种子发芽率降低,病虫害增加等,最终导致严重减产,所以,挖掘抗旱性强的花生种质成为经济有效且重要的抗旱措施。

种子萌发期是作物生长中对逆境反应最为敏感的阶段之一,萌发优劣态势极大影响作物后期群体的构建,因此,研究干旱条件下花生种子萌发受到的影响对于筛选耐旱花生种质具有重要意义。 关于不同作物种子萌发期的抗旱性研究已见诸多报道,且认为种子发芽率、发芽势、发芽指数和根长等与抗旱性密切相关[3-7]。 聚乙二醇(PEG)模拟干旱胁迫的方法具有操作简单、周期短、效率高且重复性好等优势,被广泛应用于作物早期抗旱种质资源筛选与鉴定中[8]。 张智猛等[9]利用此法研究花生品种芽期的抗旱性,发现根长、生根率和根干重与品种抗旱能力呈显著相关,且证实了17.5% PEG-6000 处理下,花生萌发期品种间差异最大,该浓度下宜进行干旱胁迫试验。 大量研究已经证实,作物在遭遇干旱胁迫时,其理化性质会发生变化,细胞内产生大量自由基,破坏作物体内活性氧代谢平衡,膜脂过氧化终产物丙二醛(MDA)含量增多,同时,作物体内超氧化物歧化酶(SOD)会清除这些自由基,减少生物膜系统的损伤,因此,干旱胁迫下,作物体内MDA 含量和SOD 活性的变化与作物抗旱性之间具有相关性。 本研究利用17.5%的PEG-6000 胁迫液模拟干旱逆境,采用隶属函数法对26 个农艺性状表现优良的花生品种种子萌发期抗旱性进行综合研究与评价,并对两个不同类群花生品种的生理差异进行分析,旨在进一步丰富花生抗旱育种种质。

1 材料与方法

1.1 试验材料

26 份花生试验材料均由山西农业大学小麦研究所花生课题组提供,具体见表1。 所有材料于2019 年10 月花生种质资源圃中获得。

表1 花生种质及来源Table 1 Peanut germplasm and source

1.2 试验设计

1.2.1 种子处理与培养方法

剥壳取出花生种仁,每份种质挑选成熟饱满、大小一致的种子,用75%的酒精消毒后,蒸馏水冲洗干净并将其浸泡12 h,取出种皮完整的种子,用滤纸吸干种子表面水分,摆放在直径150 mm、底部垫有2 层滤纸的培养皿中,每皿20 粒,加入30 mL 17.5%的PEG-6000 胁迫溶液,对照(CK)以等量蒸馏水代替,重复3 次,置于(28 ±1)℃暗培养箱中。 以放入培养箱时间为调查首日,以后固定时间观察并记录发芽情况,每日更换滤纸,并加入胁迫溶液,保证胁迫强度的稳定性[9-10]。

1.2.2 花生苗培养方法

每个品种挑选大小一致、完整饱满的种子,用75%酒精消毒10 min 后,纯水冲净表面残留乙醇,再用纯水浸泡12 h,置于垫有滤纸的培养盒中,在人工气候箱中(28 ±1)℃恒温暗培养5 d。 选取子叶展开较好且长势一致的材料移入装有Hoagland 营养液的水培盒中,每个水培盒栽种8 棵苗,每个品种移栽6 盒,3 盒做干旱胁迫处理,3 盒做对照处理,全部置于光照培养箱中,设置光暗周期16 h∕8 h,昼夜温度26 ℃∕15 ℃,第一片真叶展开时,用17.5%PEG-6000 的Hoagland 营养液做苗期胁迫处理,期间控制胁迫浓度,胁迫处理3 d 后,每两天定时摘取叶片1 次,用液氮速冻,置于-80 ℃冰箱中保存待测,连续摘取6 次。

1.2.3 指标测定与方法

胚芽突破种皮,露出3 mm 的白色芽尖为种子发芽标准。 将第1 粒种子发芽之日定为该处理发芽的开始期,以后每隔1 d 定时记录发芽种子数,当连续3 d 不再有种子发芽时作为发芽试验结束期,挑选10粒发育正常的种子,测定其胚轴长和主根长,胚根伸长长度即胚轴和主根的总长度。 计算发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、根轴比和根长胁迫指数[11-13]。 各指标计算公式如下:

1.2.4 SOD 活性和 MDA 含量测定

取0.5 g 叶片,放入冰浴的研钵中,分次加入5 mL 的pH 7.8 的磷酸缓冲液(含1%PVP 和0.2 mmol∕L EDTA),研磨,取匀浆至离心管中,12 000 r∕min 离心30 min,移出上清液,用于 SOD 和MDA 含量分析。SOD 活性测定采用氮蓝四唑(NBT)还原法,MDA 含量测定采用硫代巴比妥酸比色法。

1.3 数据处理与抗旱性评价方法

采用Excel 2010 进行数据整理,利用SPSS 24.0 进行统计学分析。 采用隶属函数方法对各抗旱性指标进行综合评价[14]。 隶属函数值公式为:μ(xj)=(xj-xmin)∕(xmax-xmin) ,j=(1,2,3,…,n)。 式中,μ(xj)为各品种第j个性状的隶属函数值,xj为各品种某一指标性状的相对值(各指标性状相对值=干旱胁迫下性状测定值∕对照处理下性状测定值),xmax和xmin分别为所有参试品种中第j个指标性状相对值的最大值和最小值。 采用标准差系数法确定指标的权重,标准差系数Pj用公式(1)计算,因子权重系数Wj用公式(2)计算,抗旱性度量值D用公式(3)计算[15-16]。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫条件下测定指标的方差分析

由表2 可知,不同品种的发芽率差异不显著;CK 和17.5% PEG-6000 处理下的发芽率存在极显著差异;浓度和品种交互效应下的发芽率存在显著差异,即不同品种在17.5% PEG-6000 胁迫处理下的反应是不同的。 发芽势和发芽指数在各品种之间和不同处理下都存在极显著差异,说明品种和17.5% PEG-6000 胁迫液对花生发芽势和发芽指数的影响均是极显著的,发芽势和发芽指数可以反映各个品种在干旱胁迫处理下的差异性,因此用发芽势、发芽指数来评价品种的抗旱性是可行的。

表2 不同处理下26 份材料发芽指标的方差分析Table 2 Variance analysis of germination indexes of 26 peanuts under different treatments

2.2 干旱胁迫条件下测定指标的变化

从表3 可见,干旱胁迫使得花生萌发期的生长受到抑制,各指标下降程度大小依次是活力指数＞发芽势＞发芽率＞发芽指数,干旱胁迫下胚轴生长受较大抑制,长度缩短,根轴比相应增加。 5 个指标在各品种间较对照处理变异系数增长倍数不同,大小依次是发芽势＞发芽率＞发芽指数＞根轴比＞活力指数,表明26 个品种的抗旱性之间存在差异。

表3 不同处理下花生萌发期各指标的变化情况Table 3 Changes of various indexes during germination period under different treatments

2.3 干旱胁迫条件下抗旱性综合评价

2.3.1 测定指标的相关分析

从表4 可见,除了相对发芽势中最大值大于1(1.029)以外,其余4 项指标数值都小于1,说明26 个品种的这些性状在干旱胁迫下均受到抑制,但各指标间的变异程度存在差异,变异系数越大,说明该性状对干旱胁迫反应越敏感,反之,变异系数越小,该性状对干旱胁迫越不敏感,各性状在干旱胁迫下的敏感程度为X4＞X5＞X2＞X3＞X1。

表4 26 个花生品种萌发期指标Table 4 Indexes for germination period of 26 peanuts

从表5 可知,种子萌发期,5 项指标之间均存在显著或极显著正相关。 根长胁迫指数(X5)越大,胚根受抑制作用越不明显,抗旱能力就越强。 相对发芽率(X1)、相对发芽势(X2)、相对发芽指数(X3)、相对活力指数(X4)均与根长胁迫指数(X5)呈现显著或极显著正相关,其中,相对活力指数(X4)和根长胁迫指数(X5)之间相关性最大(相关系数=0.983)。 这5 项指标均可用来评价花生萌发期的抗旱性。

表5 26 个花生品种萌发期测定指标的相关性分析Table 5 Correlation analysis of measuring indexes for germination period of 26 peanuts

2.3.2 花生萌发期抗旱性的综合评价

运用隶属函数法,以相对发芽率(X1)、相对发芽势(X2)、相对发芽指数(X3)、相对活力指数(X4)和根长胁迫指数(X5)5 个指标为依据,对26 个花生品种的萌发期抗旱性进行综合评价,结果用D值来反映,通常D值越高,表示该品种的抗旱能力越强,反之亦然。 表6 显示,26 份材料的综合评价D值变幅范围为0.119 4—0.973 8,差异较大,‘花育25 号’D值最大,抗旱性最强,‘白珍珠’D值最小,抗旱性最弱。

表6 26 个花生品种抗旱评价指标相对值、隶属函数值及综合评价Table 6 Relative value,membership function value and comprehensive evaluation of drought resistance evaluation index for 26 peanut varieties

2.3.3 花生萌发期抗旱性的聚类分析

依据26 份花生供试材料的综合评价结果,对供试材料进行聚类分析。 在平方欧氏距离为5 处,26 份花生材料分成5 个类群(图1),第Ⅰ类群包括4 个品种(编号:10、13、25、26),占供试材料总数的 15.4%,D值变幅范围在0.763 4—0.973 8,平均值为0.883 6,属于强抗旱型品种;第Ⅱ类群包括 9 个品种(编号:3、5、12、15、16、19、21、22、23),占供试材料总数的34.6%,D值变幅范围在0.502 4—0.700 4,平均值为0.592 6,属于较抗旱型品种;第Ⅲ类群包括 5 个品种(编号:1、9、17、18、24),占供试材料的19.2%,D值变幅范围在0.320 7—0.454 5,平均值为0.413 0,属于弱抗旱型品种;第Ⅳ类群包括6 个品种(编号:4、6、7、8、11、14),占供试材料总数的 23.1%,D值变幅范围在0.126 2—0.346 9,平均值为0.215 8,属于干旱敏感型品种;第Ⅴ类群包括2 个品种(编号:2、20)种,占总试材的7.7%,D值变幅范围在0.119 4—0.134 2,平均值为0.186 5,属于干旱高敏感型品种。

图1 26 份花生品种的萌发期抗旱性综合评价聚类分析Fig.1 Clustering analysis diagram of 26 peanut varieties on drought-resistance for germination period

2.4 干旱胁迫下花生幼苗SOD 活性变化

选择第Ⅰ类群的4 个强抗旱性品种和第Ⅴ类群的2 个干旱高敏感性品种进行生理差异性分析。 图2 显示,干旱胁迫后12 d 内,6 个花生品种的SOD 活性总体均呈现上升趋势,尤其在8—12 d 中,‘花育25’(编号10)、‘开农8 号’(编号 13)、‘晋花 8 号’(编号 25)和‘商花6 号’(编号26)的SOD 活性上升幅度明显高于之前,而‘白珍珠’(编号2)和‘花育23’(编号20)的SOD 活性上升趋势相较其他品种明显缓慢;干旱胁迫12 d 之后,‘白珍珠’(编号 2)、‘花育 25 号’(编号 10)和‘商花6 号’(编号26)的SOD 活性呈现缓慢下降趋势,‘开农8 号’(编号 13)、‘花育 23’(编号 20)和‘晋花8 号’(编号25)的SOD 活性依然有上升的表现,但上升幅度较之前明显减小。

图2 不同品种对干旱胁迫反应的SOD 活性变化Fig.2 Changes in SOD activity of different varieties in response to drought stress

从表7 可以看出,随着干旱胁迫时间增加,各品种间SOD 活性较对照表现出较大的差异。 干旱胁迫4 d,各品种的SOD 活性较对照均有所下降;干旱胁迫6 d,‘花育25 号’和‘晋花8 号’的SOD 活性较对照提高0.6%和4.6%,其余品种仍低于对照;干旱胁迫8 d,除了‘花育23’的SOD 活性略低于对照,其余品种相比对照均有所增加;干旱胁迫10—14 d 内,所有品种SOD 活性较对照均有所增加,但增幅存在差异,总体呈现强抗旱型品种‘开农8 号’、‘晋花8 号’、 ‘花育25 号’和‘商花6 号’的SOD 活性与对照相比增幅明显,而干旱高敏感型品种‘白珍珠’和‘花育23 号’的增幅相对较小。

表7 干旱胁迫下不同品种SOD 活性变化情况Table 7 Changes of SOD activity of different varieties under drought stress

2.5 干旱胁迫下花生幼苗MDA 动态变化

花生幼苗受到干旱胁迫后,体内的活性氧自由基累积并引发膜脂过氧化反应,丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的主要产物之一。 图3 显示,干旱胁迫下,第Ⅰ类群和第Ⅴ类群的6 个品种幼苗期的MDA 含量均呈上升趋势,而且在干旱胁迫4—10 d 内的MDA 累积速度最快,干旱胁迫10—14 d,除了‘白珍珠’MDA累积速度仍然很快外,其他品种累积速度变得缓慢。 干旱敏感型的2 个品种(‘白珍珠’和‘花育23 号’)MDA 含量整体高于抗旱型强的4 个品种(‘开农8 号’、‘晋花 8 号’、‘花育25 号’和‘商花 6 号’),说明干旱胁迫下,强抗旱型品种的幼苗膜脂过氧化程度小于干旱敏感型品种,可以更快抵御和适应干旱环境。

图3 不同品种对干旱胁迫反应的MDA 含量变化Fig.3 Changes of MDA content in different varieties in response to drought stress

3 结论与讨论

3.1 PEG-6000 干旱胁迫与抗旱鉴定

不同环境逆境对作物生长发育的影响程度不同,其中,作物对干旱逆境的反应最大,而且,作物不同生长阶段对干旱胁迫的反应存在差异,相对于其他生长时期,于作物萌发期进行抗旱性鉴定具有耗时短、重复性好、环境影响小等优势。 前人在小麦、玉米、大豆、绿豆、水稻和番茄等作物的萌发期都进行了抗旱性研究[4,6-7,17-20]。

目前,室内PEG 模拟干旱胁迫法是花生萌发期抗旱性鉴定与评价最常用的方法。 PEG 是一种高分子渗透剂,其浓度达到一定程度时会使植物组织和细胞处于类似干旱胁迫中。 不同作物萌发期抗旱鉴定的适宜胁迫浓度是不同的[19-20],张智猛等[21]发现,17.5%PEG-6000 胁迫条件下不同花生品种间萌发期情况差异最大,是进行干旱胁迫模拟的适宜浓度。 本研究在预备试验中采用了10% 和20% 的PEG-6000 处理花生种子,发现10%浓度处理下,种子萌发未被抑制,发芽率基本是100%,胚轴和胚根的伸长生长受抑制作用小,较对照差异不明显,而20% 浓度处理下,绝大多数的种子萌发受到严重抑制作用,甚至不萌发,因此,本研究运用17.5% PEG-6000 处理26 份供试材料,结果显示,此浓度下各品种间不同评价指标值的差异性显著,可以有效评价品种间抗旱性差异。

3.2 花生抗旱性鉴定指标的综合评价

不同花生品种对干旱胁迫的响应不同,本研究用不同指标的相对值分析抗旱性差异,减少了品种间固有差异的影响,可以更准确评判品种的抗旱性,另外,指标相对值的比较和分析也更具有科学性[22]。 本试验依据综合评价D值,通过聚类分析将26 份材料归纳为5 类群,‘花育25 号’、‘开农8 号’、‘晋花8号’和‘商花 6 号’是强抗旱型品种;‘临花8 号’、‘花育27 号’、‘963’、‘唐 8252’、‘抗3’、‘8130’、‘山花9 号’、‘开农 69’和‘海高’是较抗旱型品种;‘白沙1016’、‘山花12 号’、‘潍花13 号’、‘丰花1 号’和‘鲁花11 号’是弱抗旱型品种;‘鲁花14 号’、‘易花 13 号’、‘锦花 10 号’、‘桂花 30’、‘粤油 256’和‘丰花 6号’是干旱敏感性品种;‘白珍珠’和‘花育23 号’是干旱高敏感性品种。 从划分结果可以看出类群间或类群内的远近关系,为后续科学合理地对种质资源开展研究和利用奠定基础。

3.3 干旱胁迫下SOD 活性和MDA 含量的变化

PEG-6000 模拟干旱胁迫逆境初期,花生幼苗叶片的SOD 活性低于对照,随着胁迫时间推移,SOD 活性逐渐升高,但不同品种间存在差异,强抗旱性的花生品种较对照增幅明显,而干旱敏感型品种较对照增幅较小;MDA 是植物体内膜脂过氧化的主要产物之一,当花生在干旱胁迫环境下生长时,幼苗体内开始积累,但不同品种的MDA 累积含量随着胁迫时间的不同存在一定差异,干旱敏感型的2 个品种的MDA 累积含量总体高于其他抗旱型品种,在干旱逆境中,其体内细胞受伤害程度较高,幼苗期生长受到较大影响。 通过在逆境下对花生生理指标进行测定,可以验证抗旱性综合评价结果的有效性,同时也可作为花生抗旱性筛选的依据。

花生抗旱性是一个相当复杂的生理生化过程,是受多基因控制且复杂的生物学表现。 花生不同生长发育阶段的抗旱性因干旱胁迫程度和持续时间的变化呈现出差异,本试验从大量试验材料中快速筛选抗旱性材料,然而鉴定结果无法诠释其整个生育期的抗旱性,需在其他生育期进一步研究验证。