树莓成熟胚组织培养技术研究

杨艳敏,魏 鑫,张 舵,王 升,刘修丽,王宏光,王 莉,刘 成

(辽宁省果树科学研究所,营口 115009)

树莓为蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(RubusL.)植物,其果实富含多种维生素、超氧化物歧化酶(SOD)、花青素、鞣化酸等,具有突出的抗癌、抗衰老等保健功能,有一定的加工潜力[1-2]。 树莓果实综合开发利用途径多,国际市场需求空间大,市场前景广阔,是目前风靡世界的“第三代水果”之一。 随着国际和国内市场对高品质树莓果品及消费者对果品多样化需求的增加,以及老品种逐步表现出病害严重、种性退化、品质下降等问题,生产上进行树莓品种的更新换代和品种结构调整势在必行。

通过优良亲本组培,利用杂交技术培育优质、丰产、抗病、适应性强的优新品种是树莓产业可持续发展的原动力之一。 然而,树莓杂交种子常规播种存在萌发难、出苗慢、出苗不整齐及出苗率低等问题,阻碍了树莓杂交育种的进程。 研究表明,用浓硫酸或次氯酸盐腐蚀种壳,之后进行几周至几个月的层积(湿冷)处理,可以不同程度地提高树莓种子的萌发率,但种间差异很大,同种处理的可重复性不好[3-6]。 种皮障碍和胚未发育完全成熟是树莓种子出苗慢、出苗难的重要因素,组织培养技术可以打破树莓种子种皮障碍,在适宜的培养基上诱导种胚快速萌发、高效成苗和胚挽救,实现每一粒杂交种子萌发成苗,是培养树莓杂交种子成苗的有效措施。 本研究以多个树莓杂交组合种子为试材,进行组培技术研究,以期筛选出树莓杂交种子最佳诱导、增殖和生根培养基配方,优化组培苗田间移栽及培养流程,为树莓育种、杂交苗培养奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料选自辽宁省果树科学研究所树莓资源圃,以红树莓‘海尔特兹’ ב托拉米’(HT)、‘托拉米’ ב海尔特兹’(TH),‘秋来斯’ × ‘如贝’(QR)、‘如贝’ × ‘秋来斯’(RQ),‘托拉米’ × ‘阿岗昆’(TA)、‘阿岗昆’ ב托拉米’(AT),‘海尔特兹’ ב米克’(HM),‘米克’ × ‘海尔特兹’(MH)8 个杂交组合获得的种子为试验材料。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌材料的获得

选取发育成熟且饱满的杂交种子,首先用手术刀片将树莓种子坚硬的种皮两端切破[7],不能伤及种胚,用自来水冲洗12 h,置于超净工作台上用体积分数为75%的酒精荡洗30 s;再用质量分数为0.1%的升汞(HgCl2)溶液浸泡并不断搅动,倒去升汞溶液后用无菌水冲洗3—5 次,用无菌滤纸吸去材料上的附着水,平铺于准备好的培养基上。 用0.1%升汞灭菌的时间设5 个处理(3 min、5 min、8 min、10 min、15 min),每处理20 粒种子,3 次重复,2 周后调查灭菌效果[8]。

1.2.2 诱导培养基筛选

诱导培养基设 6 个处理,在 1∕2MS 基础上添加 6-BA 0.2 mg∕L、0.5 mg∕L、0.8 mg∕L、1.0 mg∕L、1.5 mg∕L;以不添加6-BA 为对照(CK)。 激素组合设5 个处理,在1∕2MS+6-BA 0.5 mg∕L 基础上添加 IBA 0.5 mg∕L、1.0 mg∕L、1.5 mg∕L、2.0 mg∕L、2.5 mg∕L,每处理 15—20 粒种子,每瓶 5 粒种子,3—4 瓶,3 次重复,4 周后调查试验结果。 培养基中添加蔗糖20 g∕L、琼脂4.6 g∕L。 种胚先进行7 d 暗培养后,再移入正常光照下培养,光照强度1 500—2 000 lx,温度21—23 ℃,光照时间14 h,pH 5.8。

1.2.3 增殖培养

杂交种胚发芽后,1 粒种胚萌发出1 个单芽,形成1 个株系,接种到增殖培养基上进行增殖培养。 增殖培养设 6 个处理:MS+6-BA 0.3 mg∕L、MS+6-BA 0.5 mg∕L、MS+6-BA 0.8 mg∕L、MS+6-BA 1.0 mg∕L、MS+6-BA 1.5 mg∕L,以 MS +6-BA 0 mg∕L 为对照,6 个处理均添加 GA30.5 mg∕L、IBA 0.1 mg∕L、蔗糖30 g∕L、琼脂4.6 g∕L。 每处理接种10 瓶,每瓶1 个单株,3 次重复,30 d 后调查试管苗的增殖倍数及植株生长状况[9]。 继代苗生长势可划分为5 个等级:(1)茎杆细弱,叶片微黄,生长矮小而弱;(2)茎杆细弱,叶片微黄,长势较弱;(3)茎杆中等,叶片淡绿,生长一般;(4)茎杆粗壮,叶片淡绿,生长良好;(5)茎杆粗壮,叶片浓绿,生长健壮。

1.2.4 生根培养

试管苗经增殖培养6 周后,待苗高2—3 cm 时,剪成1 cm 单芽茎段接入生根培养基中,进行生根培养,生根培养基设 6 个处理:1∕2MS + IBA 0. 1 mg∕L、1∕2MS + IBA 0.2 mg∕L、1∕2MS + IBA 0.3 mg∕L、1∕2MS+IBA 0.4 mg∕L、1∕2MS + IBA 0.5 mg∕L,以 1∕2MS + IBA 0 mg∕L 为对照,6 个处理均添加蔗糖15 g∕L、琼脂4.3 g∕L,每处理接种5 瓶,每瓶10 株,3 次重复,40 d 后调查生根株数和生根率。

1.2.5 炼苗与移栽

移栽前先将生根苗的培养瓶口打开,通风炼苗,以提高试管苗的适应能力,空气湿度保持在75%以上,移栽时用镊子取出生根苗,洗去根部附着的培养基,再用500 mg∕L 的海藻素快速浸沾后,栽入育苗盘中,基质为河沙+园田土+草炭土(基质经55%敌克松可湿性粉剂配制的0.1%水溶液加噁霉灵稀释1 000—1 500 倍喷施消毒)[9-10]。 移栽成活后,当苗高10—15 cm 时,即可转入营养钵中定植。

1.2.6 统计分析

应用DPS 7.05 数据处理软件进行Duncan,s 新复极差显著分析。

2 结果与分析

2.1 灭菌时间对污染率和种胚活性的影响

以‘海尔特兹’ ב托拉米’(HT)的杂交种子为试材,用0.1%HgCl2灭菌后进行组织培养,调查污染率和种胚活性,结果显示:树莓杂交种子处理3 min 时,组培污染率高达85%,5 min 时污染率为75%,10 min 时污染率为10%,15 min 时污染率最低,为5%,但种子褐变率达80%。 综上,0.1%HgCl2灭菌10 min 污染率为10%,种子褐变率为10%,处理效果最佳(表1)。

表1 0.1%HgCl2 处理时间对树莓种胚的灭菌效果Table 1 Sterilization effect of 0.1% HgCl2 treatment time on raspberry seed embryo

2.2 不同浓度6-BA 对树莓种胚发芽的影响

以‘海尔特兹’ ב托拉米’(HT)、‘托拉米’ ב海尔特兹’(TH)、‘托拉米’ × ‘阿岗昆’(TA)、‘阿岗昆’ ב托拉米’(AT)正反交组合的种子为试材,灭菌后在添加不同浓度6-BA 的诱导培养基上培养,调查发芽率。 结果显示:经过3—4 周的培养后,树莓同一父母本的正反交杂交种子在同一浓度6-BA 培养基上培养效果有所不同,但差异不明显。 从表2 可以看出,以1∕2MS 为基本培养基,HT 与TH 的种胚在附加6-BA 0.5 mg∕L 培养基上的发芽率为53.4%—87.8%,效果最好;而TA 与AT 的种胚在6-BA 质量浓度为0.8 mg∕L 时发芽效果最好,发芽率为62.2%—56.6%。 对照只有1 粒种子萌发,说明6-BA 在种胚萌发中起着决定性作用。

表2 不同浓度6-BA 对树莓种胚发芽的影响Table 2 Effects of different concentrations of 6-BA on seed embryo germination of raspberry

2.3 6-BA 与IBA 配合使用对树莓种胚发芽的影响

以‘秋来斯’ × ‘如贝’(QR)、‘如贝’ ב秋来斯’(RQ)、‘海尔特兹’ × ‘米克’(HM),‘米克’ × ‘海尔特兹’(MH)的杂交种子为试材,在诱导培养基中添加0.5 mg∕L 6-BA 和不同浓度IBA 进行培养,调查发芽率。 从表 3 可以看出,当 6-BA 质量浓度为 0.5 mg∕L、IBA 为 1.5 mg∕L 时,QR 与 RQ 种胚的发芽率最高,分别是62.2%、71.2%;而HM 与MH 种胚在IBA 质量浓度2.0 mg∕L 时,萌发率最高,分别是84.4%、88.9%;当IBA 为2.5 mg∕L 时,种胚的发芽率明显下降,只有26.7%—31.1%。 由此看出,当IBA 的浓度增加到一定程度时,抑制了种胚的萌发。

表3 6-BA 与IBA 配合使用对树莓种胚发芽的影响Table 3 Effects of 6-BA combined with IBA on seed embryo germination of raspberry

2.4 不同浓度6-BA 对树莓试管苗增殖的影响

由表4 可以看出,杂交后代试管苗在 IBA 质量浓度为0.1 mg∕L、GA3为 0.5 mg∕L 时,随着6-BA 浓度增大,其增殖倍数和生长状态呈上升趋势且生长健壮,当达到一定浓度时,增殖倍数和生长状态有所下降。 HT、TH 与 AT 试管苗在附加 6-BA 0.5 mg∕L 培养基上的增殖倍数高达 3.6 倍、4.23 倍与 4.27 倍,且试管苗茎杆粗壮,叶片浓绿,生长健壮。 当6-BA 达 1.5 mg∕L 时,增殖倍数下降至 1.5 倍、2.07 倍和1.63 倍,且茎杆中等变弱,叶片淡绿至微黄,生长一般或较弱。 而TA 试管苗在附加6-BA 0.8 mg∕L 培养基上的增殖倍数高达4.87 倍,且试管苗茎杆粗壮,叶片浓绿,生长健壮。 当6-BA 达1.0 mg∕L 和1.5 mg∕L时,增殖倍数分别下降至2.7 倍、2.07 倍,且茎杆中等变弱,叶片淡绿至微黄,生长一般或较弱。 6-BA 浓度为0(CK)时,4 个杂交后代试管苗的增殖倍数为1.2—2 倍,茎杆细弱,叶片微黄,生长势较弱。 从表4还可以看出,在同一条件下HT 试管苗的增殖倍数与生长状况都不如TH,而TA 试管苗与AT 试管苗没有明显差异。

表4 不同浓度6-BA 对树莓试管苗增殖的影响Table 4 Effects of different concentrations of 6-BA on the proliferation of raspberry plantlets in vitro

2.5 不同浓度IBA 对树莓试管苗生根的影响

由表5 可以看出,当 IBA 质量浓度为 0.3 mg ∕L 时,杂交后代 QR、WH、HW 的生根率分别达到93.83%、96.35%、92.09%,显著高于其他处理与对照,随着IBA 浓度的加大,生根率不断降低;而杂交后代RQ 在IBA 为0.2 mg∕L 时生根率最高,达95.25%,显著高于其他处理与对照。

表5 不同浓度IBA 对树莓试管苗生根的影响Table 5 Effects of different concentrations of IBA on rooting of raspberry plantlets in vitro

2.6 田间移栽

移入育苗盘深度0.5 cm,封严根际,随栽随浇透水,栽后上搭小拱棚无纺布保湿,上覆75%—80%的遮阳网。 5—7 d 时喷杀菌剂,移栽10—15 d 时,所盖无纺布可两侧揭开,定时通风,并增加光照,光强时仍须遮阳。 此时开始浇施营养液(EC 1.0—1.3 mS∕cm),4—5 d 一次,可采取水肥交替,一周喷1 次保护性药剂;移栽15—30 d 时植株开始生长,去掉无纺布及遮阳网,全光照,而后水肥4—5 d 一次,营养液EC 1.3—1.5 mS∕cm。 当植株生长健壮,新叶3—5 片且叶浓绿,高度1—1.5 cm,根数20—30 条,根长度1—2 cm 时,可移植到小营养钵中。

3 结论与讨论

树莓种皮坚韧、质密、休眠期长,是影响种子萌发的关键因素,常规层积沙藏方法播种出苗率极低(0.6%),最高才1.1%,并费时费工[11-12]。 目前,浓硫酸处理是解除种皮障碍的主要方法,已有报道中浓度硫酸处理树莓种子的研究。 王菲等[13]用98%浓硫酸处理15 min 加20%次氯酸钠处理3 h,供试树莓种子萌发率为48.87%。 卢晶晶等[14]用80%硫酸处理澳洲红种子,最高发芽率为61.8%。 段修安等[15]用75%硫酸处理8—10 min 后用0.8%尿素浸种34 h,野生树莓最高发芽率为58.49%。 浓硫酸与其他试剂配合较常规播种树莓种子萌发率显著提高,但不同品种及不同组合杂交种子种皮厚度及质密程度存在差异,浓硫酸处理时间及浓度的准确把握难度较大,处理不当会导致种胚死亡或种皮炭化不足而起不到解除种皮障碍的目的,存在一定风险,从目前的报道看萌发率并不能满足育种需求。 组织培养技术可以打破树莓种子种皮障碍,在适宜的培养基上诱导种胚快速萌发、高效成苗和胚挽救,所以,筛选适合树种的种胚最佳诱导、增殖和生根培养基配方是实现杂交种子萌发成苗的关键。

本试验基于树莓不同品种杂交组合的种子进行灭菌及培养基条件优化,表明种胚用0.1%升汞灭菌10 min 效果最佳。 在现有报道中,树莓成熟胚组织培养以1∕2MS 为基本培养基,加蔗糖30 g∕L 及琼脂4.6 g∕L。 本试验在基本培养基基础上添加6-BA 和IBA,发现6-BA 和IBA 浓度对不同组合杂交种子的萌发率影响稍有差异,其中组合HT 与TH 的杂交种子种胚在添加0.5 mg∕L 6-BA 时的萌发率最高,分别为53.4%、87.8%,而 TA 与 AT 的种胚在添加0.8 mg∕L 6-BA 时萌发效果最好,萌发率分别为62.2%、56.6%。 当固定6-BA 为0.5 mg∕L,培养基中添加IBA,种子萌发率会进一步提高,其中0.5 mg∕L 6-BA +1.5 mg∕L IBA 处理的 QR 与 RQ 种胚的萌发率最高,分别为 62.2%、71.2%,而 HM 与 MH 种胚在0.5 mg∕L 6-BA+2.0 mg∕L IBA 时,萌发率最高,分别为 84.4%、88.9%。 杂交种子萌发率显著提高,说明适当浓度的6-BA 和IBA 对树莓种子萌发有明显促进作用。

在树莓常规增殖培养基中,添加GA3可促进组培苗茎和叶生长。 本试验在萌发培养基MS +蔗糖30 g∕L+ 琼脂 4.6 g∕L+6-BA(0.5—0.8)mg∕L +IBA 0.1 mg∕L 的基础上添加 GA30.5 mg∕L,供试 HT、TH与AT 组合试管苗增殖倍数在3.60—4.27,显著高于对照,且植株生长健壮,表现为茎杆粗壮、叶片展开、株高增长,可见 GA3在树莓种胚增殖培养过程中也发挥着重要作用。 以1∕2MS + 蔗糖15 g∕L + 琼脂4.3 g∕L 为基本培养基,IBA 增加到0.2—0.3 mg∕L 时,供试材料试管苗生根率均大于90%,最高达到96.35%,显著高于对照,可见高浓度IBA 可促进树莓组培苗生根。

综上所述,针对树莓杂交种子成熟胚优化的诱导、增殖和生根培养基可显著提高树莓杂交种子成熟胚的萌发、成苗和生根,为解决树莓种子萌发难、萌发时间长、整齐度差等问题提供了一条新的途径,为树莓育种杂交苗培养奠定了基础。