膈下逐瘀汤“异病同治”子宫内膜异位症、多囊卵巢综合征的作用机制探讨

徐嘉碧，梁齐桁，郭雯雯，程兰

1广州中医药大学第二临床医学院，广州 510405；2广东省中医院妇科；3肇庆医学高等专科学校临床医学系

子宫内膜异位症（EMs）和多囊卵巢综合征（PCOS）是妇科常见病，现代医学对其发病机制均不甚清楚，治疗手段十分有限，而中医确有一定的优势。祖国医学认为，EMs的主要病机是气血失和，冲任损伤，致经血不循常道而逆行，化为瘀血阻滞冲任和胞宫；而PCOS发病以肾虚为主，致肝失疏泄，肝气郁结，气滞血行受阻，形成瘀血阻滞冲任、胞宫；两者的共同病机是“气滞血瘀”。膈下逐瘀汤出自清代《医林改错》，是治疗气滞血瘀证的代表方，临床上治疗气滞血瘀证EMs和PCOS疗效显著［1-5］。但膈下逐瘀汤成分多，作用靶基因复杂，如何“异病同治”EMs和PCOS的分子机制仍不清楚，依靠传统药理学的研究方法难以有效阐明其作用机制。网络药理学是新兴的中药复方研究方法，通过构建“药物—成分—靶基因”网络，运用网络拓扑学方法发现网络核心，能对中药复方的复杂机制进行整体研究，有助于发现膈下逐瘀汤治疗“气滞血瘀证”的核心机制。本研究运用网络药理学方法，分析膈下逐瘀汤对EMs和PCOS“异病同治”的分子作用机制。

1 资料与方法

1.1 膈下逐瘀汤活性成分及作用靶基因筛选 在中药系统药理学数据库与分析平台（TC‐MSP，https：//www.tcmsp-e.com/）在线下载获取膈下逐瘀汤中每一味中药的活性成分，根据活性成分的药物动力学吸收、分布、代谢、排泄（ADME）参数，筛选口服生物利用度（OB）≥30%，以及类药物指数（DL）≥0.18的活性成分。每个活性成分的作用靶基因通过检索TCMSP数据库获取，并筛选出属于人类的靶基因，用于构建“中药—化合物—靶基因”网络。

1.2 EMs、PCOS疾病相关靶基因筛选 及其与膈下逐瘀汤作用靶基因的共有靶基因获取本研究通过MalaCards人类疾病数据库（https：//www.malac‐ards.org/）和CTD数据库（http：//ctdbase.org/）获得与EMs、PCOS疾病相关的靶基因，CTD数据库获得的疾病相关靶基因按照“有直接证据”或推断得分≥20进行筛选，筛选获得的相关靶基因用于下游分析。将以上EMs、PCOS疾病相关靶基因与“1.1”中获得的膈下逐瘀汤作用靶基因取交集，获得“异病同治”的共有靶基因。交集韦恩图使用在线韦恩图工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）绘制。将膈下逐瘀汤的药物、活性成分及上述共有靶基因导入Cytoscape3.8.2软件构建“药物—化合物—靶基因”网络，展示膈下逐瘀汤药物、活性成分与共有靶基因蛋白的作用情况。

1.3 膈下逐瘀汤治疗EMs、PCOS共有靶基因的基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析 使用R4.1.0软件和clusterPro‐filer包对共有靶基因进行GO和KEGG信号通路富集分析，以了解共有靶基因的功能和所涉及信号通路。将共有靶基因输入enrichGO和enrichKEGG函数，校正P值方法选择FDR。校正P值<0.05的GO条目或信号通路被认为是显著富集，与研究疾病完全无关的信号通路会被剔除。

1.4 膈下逐瘀汤治疗EMs、PCOS共有靶基因的蛋白质相互作用（PPI）网络构建及核心靶基因的筛选 将共有靶基因输入STRING11.5在线数据库（https：//string-db.org/），构建共有靶基因的PPI网络，以了解靶基因间的相互作用。蛋白间相互作用的强度以联合分数（combined score）衡量，以分数>0.9作为筛选标准。PPI网络导入Cytoscape3.8.2软件构建网络蛋白互作图，并使用cytoHubba和MCODE插件进行网络拓扑分析，以筛选膈下逐瘀汤治疗EMs、PCOS的核心靶基因和核心子网络。Cyto‐Hubba插件计算的最大派系中心度（MCC）用于衡量靶基因蛋白在网络中的重要性，MCODE插件用于聚类核心子网络。

1.5 膈下逐瘀汤治疗EMs、PCOS核心成分与核心靶基因的分子对接验证 使用SwissDock在线分子对接工具（http：//www.swissdock.ch/），选取“1.4”中筛选出的重要核心靶基因，与作用于这些靶基因的膈下逐瘀汤核心成分进行分子对接，以进一步验证成分分子和靶基因的相互作用，并可具体了解其结合能力强弱。核心靶基因的三维结构从PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）获取，膈下逐瘀汤成分分子的结构（mol2格式）从TCMSP网站下载。靶基因蛋白与分子的结合能力用结合自由能ΔG衡量，并设定ΔG<－5 kcal/mol为结合具有显著性，以进一步验证膈下逐瘀汤成分与EMs、PCOS核心靶基因的相互作用。

2 结果

2.1 膈下逐瘀汤活性成分及作用靶基因筛选结果 在TCMSP在线数据库分别检索膈下逐瘀汤成分，共获得活性成分1 349个，其中甘草280个、川芎189个、红花189个、乌药128个、当归125个、赤芍119个、香附104个、延胡索77个、桃仁66个、丹皮55个、枳壳17个。按照OB≥30%和DL≥0.18筛选并去重后，共获得活性成分261个。这些活性成分共检索到306个人类蛋白药物靶基因。

2.2 膈下逐瘀汤治疗EMs、PCOS的共有靶基因获取结果 通过检索MalaCards和CTD在线数据库，并按照“有直接证据”或推断得分≥20进行筛选，共获得EMs相关靶基因485个，PCOS相关靶基因2494个。将上述EMs、PCOS相关靶基因与306个膈下逐瘀汤作用靶基因取交集，获得共有靶基因69个：MMP2、MAOA、CYP1A1、PTGES、CYP19A1、GNRH1、LDLR、SPP1、PTGS2、CTNNB1、CCND1、ESR1、VEGFA、TGFB1、CCNA2、TIMP1、GSK3B、SLC2A1、MMP3、GSTM1、IL-10、EGFR、SOD1、AKR1B1、NCOA1、RB1、CDK2、RUNX2、PGR、CX‐CL10、TP53、AKR1C1、IL-1B、NFKBIA、ESR2、CYP1B1、PTGER3、PTEN、GJA1、FASN、CLDN4、RXRA、APOB、PPARG、CXCL8、SELE、NR3C1、HSD3B1、CHUK、BAD、CCL2、IL-6、KDR、SULT1E1、PPARA、MAOB、IGF2、FOS、IFNG、CAV1、BCL2L1、VCAM1、AKR1C3、PTGS1、F3、JUN、AR、MMP9、ADI‐POQ。膈下逐瘀汤药物靶基因与EMs、PCOS两种疾病相关靶基因的交集关系用韦恩图可视化，见图1。膈下逐瘀汤“异病同治”EMs、PCOS的“药物—活性成分—作用靶基因”网络图，见图2。此网络由279个节点、1 538条边组成，其中矩形节点为药物，三角形节点为活性化学成分，围绕同一矩形节点的三角形表示该药物的活性化学成分，椭圆形节点为共有靶基因。可见，同一化学成分可作用于多个靶基因，提示膈下逐瘀汤可通过多成分、多靶点作用于EMs、PCOS。

2.3 膈下逐瘀汤治疗EMs、PCOS共有靶基因的GO和KEGG通路富集分析结果 对69个共有靶基因进行GO信号通路富集分析，共得出生物过程（BP）1 548个、分子功能（MF）109个、细胞成分（CC）44个；KEGG信号通路富集分析共得到校正P值小于0.05的通路共15条。其中，BP包括对类固醇激素的反应、对酮体的反应、细胞对化学压力的反应、多细胞生物体过程、女性怀孕、对脂多糖的反应、对细菌来源的分子的反应、对雌二醇的反应、炎症反应的调节、细胞对活性氧的反应等；CC包括RNA聚合酶Ⅱ转录调节器复合物、细胞器外膜、外膜、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合体等；MF包括胞核受体活性、配体激活的转录因子活性、细胞因子活性、甾体激素受体活性、DNA结合的转录因子结合、受体配体活性、信号受体激活剂活性、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、类固醇结合、细胞因子受体结合等。显著富集的KEGG信号通路主要有与炎症相关的IL-17信号传导途径、TNF信号传导途径、Toll样受体信号传导途径、Th17细胞分化，与血管相关的脂质和动脉硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化，与激素相关的内分泌抵抗、卵巢类固醇生成、类固醇激素的生物合成、甲状腺激素信号传导途径、雌激素信号传导途径，其他的有PI3K-Akt信号通路、子宫内膜癌、人乳头瘤病毒感染、局部黏附等信号通路。

图1 膈下逐瘀汤治疗EMs、PCOS共有靶基因韦恩图

图2 膈下逐瘀汤治疗EMs、PCOS“药物—成分—共有靶基因”网络图

2.4 膈下逐瘀汤治疗EMs、PCOS共有靶基因的PPI网络构建及核心靶基因筛选结果 将69个共有靶基因输入STRING数据库，构建靶基因蛋白相互作用网络，导入Cytoscape3.8.2软件分析后获得膈下逐瘀汤“异病同治”EMs、PCOS共有靶基因的PPI网络图，以展示靶基因间的相互作用关系，如图3A。图中节点为共有靶基因蛋白，边为蛋白间的相互关系。PPI网络图包括62个节点，192条边，平均度值为0.97，提示这些共有靶基因间存在直接的相互关系。蛋白质相互作用联合分数排名靠前的分别为CTNNB1与JUN、ESR1与JUN、FOS与JUN等。为了确定PPI网络中的核心靶基因，使用CytoHubba插件计算出MCC分值，靶基因蛋白颜色按分值从低到高用“黄色—红色”标记。得分较高的核心靶基因包括IL-10、IL-6、JUN、IL-18、CCL2、CXCL8、MMP9等，表明这些靶基因在膈下逐瘀汤治疗EMs、PCOS中具更为重要作用。为了确定PPI网络中的核心子网络，使用MCODE插件进行模块分析，共有4个子网络，见图3B～3E。子网络1包括IL-1B、CCL2、CXCL8、CXCL10，子 网 络2包 括VEGFA、MMP2、MMP3、MMP9、TIMP1，子网络3包 括IL-6、IL-10、IFNG、JUN、NR3C1、AR、NCOA1、ADIPOQ，子网络4包括AKR1C1、AKR1C3、HSD3B1、CYP19A1、SULT1E1。同一模块中的蛋白间存在着紧密联系，各模块均具有生物学意义，其中子网络1和3与与炎症因子、炎症趋化因子以及对炎症的反应有关，子网络2与血管生成有关，子网络4与类固醇激素/卵巢激素合成信号通路有关，表明这4个子网络中的靶基因和所涉及的功能或通路在膈下逐瘀汤治疗EMs、PCOS中起到关键作用。

图3 膈下逐瘀汤治疗EMs、PCOS共有靶基因PPI网络与核心子网络

2.5 膈下逐瘀汤治疗EMs、PCOS核心成分与核心靶基因的分子对接结果 MCC得分排名前3的核心靶基因为IL-10、IL-6、JUN，作用于上述核心靶基因的膈下逐瘀汤核心成分有8种，分别是木犀草苷、槲皮素、芍药苷、β-谷甾醇、甲醛、山奈酚、β-胡萝卜素和金钗素。将核心靶基因IL-10、IL-6、JUN与膈下逐瘀汤8种核心成分进行线上分子对接，结果显示膈下逐瘀汤8种核心成分与核心靶基因IL-10、IL-6、JUN的结合自由能在-8.30～-6.43 kcal/mol，均小于-5 kcal/mol，提示膈下逐瘀汤成分能与核心靶基因形成稳定的复合结构。其中，IL-10与槲皮素结合性最强，IL-6与芍药苷结合性最强，JUN与β-胡萝卜素结合性最强。以上结果表明，这8个成分是膈下逐瘀汤治疗EMs、PCOS的核心成分，它们可能通过与IL-10、IL-6或JUN直接结合后激活下游通路发挥治疗作用。

3 讨论

EMs和PCOS均是妇科中常见且复杂、难治的疾病。EMs作为一种慢性、难治性疾病，临床常见进行性加重的盆腔疼痛、盆腔包块及不孕等症状，且该病具有雌激素依赖的特性，术后复发率可高达40%以上，严重影响患者的健康和生活质量［6］。西医在治疗EMs临床症状及预防术后复发方面，首选激素治疗，但其不良反应及复发率高仍是临床应用的问题所在［7］。而中医药治疗EMs在降低术后复发率、改善不良反应、改善临床症状等方面疗效显著［8］。PCOS是一种复杂的、病因不明的异质性疾病，病程长，存在生殖功能障碍与糖代谢异常并存的特点，常导致女性排卵障碍性不孕、月经失调和高雄激素等。西医治疗PCOS主要针对患者具体症状及生育要求对症治疗，首选生活方式干预、药物治疗等保守性治疗。单纯运用西药治疗PCOS可明显提高患者排卵率，但流产率也会相应升高，妊娠率降低，且不良反应较大，而中医治疗能多方位全面显著改善症状，且不良反应较小［9］。因此，对中医药治疗EMs和PCOS的机制进行研究，有助于为EMs和PCOS的治疗找到新的治疗靶基因和方法。

膈下逐瘀汤出自清代王清任所著的《医林改错》，方中桃仁、红花活血化瘀，当归、川芎、赤芍活血养血，丹皮凉血活血；灵脂破血逐瘀消积，香附、乌药、枳壳、元胡行气止痛，甘草调和诸药。诸药合用，共奏活血化瘀，行气止痛的功效。临床研究表明，膈下逐瘀汤对病机为气滞血瘀的疾病具有“异病同治”的作用，如冠心病、慢性胃病、结肠炎、妇科系统疾病等［10］。在妇科系统疾病方面，该方用于治疗EMs和PCOS有不错的疗效，如赵莉［1］运用膈下逐瘀汤治疗EMs，中药组总有效率96.25%，优于长效达菲林组。运用膈下逐瘀汤联合西药治疗EMs，疗效显著优于纯西药组［2-3］。研究［4-5］表明，膈下逐瘀汤联合西药治疗PCOS，总有效率为87.90%～95.53%，优于纯西药治疗。可见膈下逐瘀汤对EMs和PCOS两种难治的妇科疾病有“异病同治”的功效，对该经典名方的作用机制进行深入的研究十分必要。

激素水平的异常是EMs和PCOS的重要发病机制。EMs的进展会受到雌激素作用的促进，因此影响雌激素合成的一些关键基因及雌激素受体的异常表达会影响EMs的进展［11-14］。并且不同亚型孕激素的抵抗也是EMs发病的重要机制［15］。而PCOS则存在明显的高黄体生成素和高雄激素血症［16-18］。调节这些激素的生成、分泌水平和机体对其反应等，已成为治疗EMs和PCOS的重要靶基因。本研究显示，膈下逐瘀汤治疗EMs、PCOS的共有靶基因共69个，GO和KEGG富集分析结果显示共有靶基因显著富集于激素相关功能和信号通路，如类固醇激素的反应、对酮体的反应、对雌二醇的反应、甾体激素受体活性、类固醇结合等GO条目，和激素相关的内分泌抵抗、卵巢类固醇生成、类固醇激素的生物合成、雌激素信号传导等信号通路，表明膈下逐瘀汤可广泛调节相关激素的生成和机体对其的反应。一些实验研究证实了膈下逐瘀汤对相关激素的调控作用，如姜晓琳等的研究发现膈下逐瘀汤可调节PCOS患者黄体生成素、雌二醇、总睾酮水平［19］，王红等［20］发现膈下逐瘀汤可调节EMs患者雌二醇、卵泡刺激素、黄体生成素、孕酮水平。本研究发现，膈下逐瘀汤调控这些激素的靶基因可能是MMPs、ESR1/2、CYP19A1、CYP1A1、CYP1B1、17β-HSD、LDLR等基因，为后续深入的机制研究指明了方向。炎症也与EMs和PCOS的发病相关，多种炎症因子及免疫调节因子参与的低度炎症可能参与了HPO轴功能紊乱及卵泡发育障碍的过程［21-22］。EMs腹腔内环境中免疫细胞、细胞因子等有着显著的变化，可能是造成子宫内膜细胞异常定植的原因［23］。PCOS也存在慢性炎症情况，可能介导了胰岛素抵抗的发生［24］。因此，膈下逐瘀汤对炎症的调控可能也是治疗EMs和PCOS的机制之一。本研究发现，膈下逐瘀汤对IL-17、TNF、Toll样受体信号传导途径、Th17细胞分化具有调控作用。对这些通路的调控作用在一些膈下逐瘀汤的动物研究中获得了证实［25］，但在EMs和PCOS仍需要进一步的实验验证。此外，血管新生也是EMs和PCOS的重要机制之一。在EMs早期阶段，异位子宫内膜组织迅速建立自己的血液供应，这是其成功植入和长期存活的先决条件［26］，而卵巢间质的血管生成增加同样是PCOS的特征之一［27］。活血化瘀中药对血管新生的作用已被广泛证实［28］。本研究发现，膈下逐瘀汤作为活血化瘀的代表方，对促进血管生成的因子VEGF、MMP2、MMP9具有显著调控作用，这些因子也是蛋白互作网络中核心子网络2的主要成分。对69个共有靶基因进行蛋白相互作用分析并构建互作网络，运用网络拓扑算法进行网络核心计算，发现网络中最核心的3个靶基因为IL-6、IL-10和JUN，其中IL-6和IL-10属于炎症因子，JUN属于对多种基因具有调控作用的转录因子。运用MCODE计算则发现4个核心子网络，子网络1和子网络3中的基因均与炎症因子、炎症趋化因子以及对炎症的反应有关，子网络2与血管生成密切相关，而子网络4中的基因则均属于类固醇激素/卵巢激素合成信号通路。这与富集分析中共有靶基因主要富集在激素、炎症和血管生成的结果一致，并进一步缩小了范围，明确了其中的核心靶基因。本研究分子对接结果显示，膈下逐瘀汤成分能与核心靶基因形成稳定的复合结构，进一步明确了膈下逐瘀汤对核心靶基因的作用。

总之，中医经典名方膈下逐瘀汤对EMs和PCOS“异病同治”的分子作用机制是多靶基因、多通路的复杂过程，其核心成分为木犀草苷、槲皮素、芍药苷、β-谷甾醇、甲醛、山奈酚、β-胡萝卜素、金钗素等，调控的核心蛋白为IL-10、IL-6、JUN，主要生物功能和信号通路与调节激素水平和反应、调控炎症、调节血管生成等有关。基于网络药理学研究结果，可进一步开展多靶基因、多通路的药理学验证，为深入阐明膈下逐瘀汤的分子作用机制提供新思路。