基于气相色谱-串联质谱法测定栀子饮片中农药残留

刘杰，苟琰,，高必兴,，钟恋,，蒙春旺，耿昭▲，郭力▲

(1.成都中医药大学 药学院西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137； 2.四川省食品药品检验检测院，成都 611731)

栀子为茜草科栀子属栀子GardeniajasminoidesEllis 的干燥成熟果实，东汉《神农本草经》中最早提及，在我国有广泛的分布，是原国家卫生部发布的第一批药食两用资源品种，《中国药典》[1]中描述其功效为“泻火除烦，清热利湿，凉血解毒”，现代药理研究表明其具有降血糖血压、调节血脂、保肝利胆、缓解疲劳、抗炎、抗氧化、抗血栓和保护神经等多种生物活性[2-3]。随着人们对健康生活的追求不断提高，栀子的保健作用受到越来越多的关注，除药用外，栀子被广泛应用于保健品和食品的研究与开发中，并且已开发出功能性饮料、保健茶、保健酒、栀子果油等产品[4-6]，在人们的生产和生活中发挥着重要的作用。

近年来，关于蔬菜、瓜果、茶叶和中药材等农药残留的报道[7-9]层出不穷，让大家心生疑虑。栀子生长过程中，有蚜虫、花面天蛾幼虫、灰蝶、红蜡蚧等虫害以及炭疽病、斑枯病等真菌感染[10-12]，为提高栀子产量，农药的使用不可避免。但其大量使用必然会危害人体健康并对环境造成污染。栀子的农药残留检测显得尤其重要，它直接关系到相关药品和食品的安全性，同时对于指导和提高栀子的规范化种植具有重要意义[13-14]。色谱-质谱联用技术凭借其高灵敏度、强专属性、同时定性定量和检测高通量等优势成为目前最为重要的农药检测手段[15]。本研究采用气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)联用技术对市场上收集的105批栀子饮片中不同种类农药进行分析，涵盖常用的有机磷、氯类和拟除虫菊酯类等共计57种，以期为栀子的种植和开发提供依据。

1 实验材料

1.1 主要仪器

配备电子轰击离子源(EI)的GCMS-TQ8040三重四级杆型气质联用仪(日本Shimadzu)；弹性石英GC毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，DB-17 ms，美国Agilent)；AOC-6000 CTC进样器(瑞士CTC Analytics)；MS3 digital涡旋振荡混合器(德国IKA)；3-30k低温离心机(德国Sigma)；Mill-Q纯水仪(美国Millipore)；WondaPak QuEChERS 15 mL C18/PSA/GC-e/硅胶净化管(日本Shimadzu)；C18固相萃取柱(中国Bonna-Agela Technologies)；HLB固相萃取柱(美国waters)；PSA填料(中国Bonna-Agela Technologies)。

1.2 药材与试剂

WondaPak QuEChERS醋酸钠提取管：6 g MgSO4、1.5 g NaOAc(日本Shimadzu，批号：5010-050020)；分析保护剂：D-(+)-Ribonic Acid gamma-Lactone(北京百灵威科技，批号：20205336083)；乙腈和丙酮均为色谱纯(美国Fisher Chemical，批号：MFCD00001878、MFCD00008765)；冰醋酸为分析纯(成都科隆化学品有限公司，批号：2020072001)；水为超纯水。

敌敌畏等57种农药对照品分别购自Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司(德国)、AccuStandard Inc 公司(美国)、农业部环境保护科研监测所(AEPI)、北京曼哈格生物科技有限公司,具体信息见表1。105 批栀子样品由各中药材饮片企业送样或药房购买，栀子样品由成都中医药大学高继海副教授鉴定为为茜草科栀子属栀子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果实。样品信息及编号见表2。

表1 农药对照品信息

表2 样品信息

(见续表2) 续表2

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

色谱柱：DB-17 ms型弹性石英GC毛细管柱；升温程序：起始温度为60℃，恒温1 min，以10℃min的速率升至160℃，以2℃/min的速率升至230℃，以15℃/min的速率升至300℃，恒温6 min，最后以25℃/min的速率升至320℃，恒温5 min，不分流进样1 μL；柱流速为线速度控制模式，初始流速1.3 mL/min；进样口温度为240℃。离子源条件：70 eV，EI离子源温度200℃，接口温度280℃[16]。

2.2 溶液的制备

2.2.1 内标溶液

取1 μg/mL 的磷酸三苯酯乙腈溶液2 mL，加乙腈稀释50倍至100 mL容量瓶中，摇匀，即得(每1 mL含内标磷酸三苯酯约20 ng)。

2.2.2 对照品贮备液

在配制混标工作液时，由于常用农药中不同化合物的响应情况不同，故配制样品浓度各不相同；禁限用农药的配置参考拟定限：分别移取相应量的标准贮备液，用丙酮配制成5～50 μg/mL的混标溶液，作为混标贮备液。

2.2.3 供试品溶液

取栀子饮片粉碎后过三号筛粉末3.0 g，精密称定，置50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，加入1%CH3COOH溶液15 mL，使用涡旋仪对药粉进行涡旋使其充分浸润，静置30 min，精密加入乙腈15 mL，置振荡器上以2 000次/min的频率剧烈振荡20 min。冰箱中冷冻静置30 min，加入无水MgSO4与无水NaOAc的混合粉末(4∶1)7.5 g，震摇使其均匀分布，再以2 000次/min的频率置振荡器上剧烈振荡10 min，而后以离心半径8 cm,速率8 000转/min离心5 min，精密量取上清液3 mL，氮吹至约0.1 mL，加丙酮使溶解并定容至2 mL，精密量取摇匀后的溶液1 mL，加入内标溶液0.3 mL，摇匀，即得。作为供试品溶液。

2.2.4 基质匹配标准工作液

取基质(无检出农残的栀子样品)3.0 g，以与供试品溶液相同的制备方法进行处理，精密量取上清液3 mL，置氮吹仪上，且于温水浴(约40℃)浓缩至约0.1 mL，分别加入混标工作液(混标贮备液稀释50倍) 2、4、10、20、40、100、200 μL，加丙酮定容至2 mL，精密量取1 mL，加2.2.1内标溶液0.3 mL，摇匀，用微孔滤膜(0.22 μm)滤过，分别作为ST 1-ST 7，供GC-MS/MS测定。

2.3 系统适用性试验

结合前期工作基础，并以基质加标进行验证，选择响应高、无基质干扰的MRM模式采集。禁限用农药质谱条件参考验证条件，常用农药参考岛津数据库中MRM方法进行，MRM色谱图见图1，混标MRM参数见表3。

图1 混标MRM(GC-MS/MS)

表3 GC-MS/MS农药分组、保留时间及定量、定性离子的选择

(见续表3) 续表3

2.4 线性关系与检测限考察

取对照品，加空白基质配制成浓度为1×103～1×104ng/mL的混合对照品贮备液作为st①；精密量取st① 0.1 mL，加入空白基质0.9 mL，混合均匀，作为st②；精密量取st①0.05 mL，加入空白基质0.95 mL，混合均匀，作为st③；精密量取st①0.02 mL，精密加入空白基质0.98 mL，混合均匀，作为st④；精密量取st①0.1 mL，精密加入空白基质0.9 mL，混合均匀，作为st⑤；精密量取st②0.1 mL，精密加入空白基质0.9 mL，混合均匀，作为st⑥；精密量取st③0.1 mL，精密加入空白基质0.9 mL，混合均匀，作为st⑦；精密量取st④0.1 mL，精密加入空白基质0.9 mL，混合均匀，作为st⑧。st②～st⑧，液质检测指标直接进样检测，气质混标分别精密加入内标溶液0.3 mL，混合均匀，分别精密吸取上述7种溶液各1 μL，注入GC-MS/MS系统，记录测定峰面积值并绘制标准曲线。相关系数(r)均大于0.998 9，表明线性关系良好。

将标准曲线中st⑦、st⑧，分别注入气质联用仪，视各峰响应情况，选择不同浓度进样，以下列公式计算其检出限。绝大多数农药检测限均小于 0.01 mg/kg。

2.5 精密度考察

取st⑤，注入液质联用仪直接重复进样6次，气质混标分别精密加入分析用内标0.3 mL，混匀，再次重复进样6次，以测定后的峰面积值进行计算，各目标物的相对标准偏差均小于15.00%，表明仪器精密度满足试验需求。

2.6 回收率考察

取测定样品进行加样回收率试验，分别精密加入气质混合对照品贮备液各20 μL(2 LOD)、50 μL(5 LOD)、100 μL(10 LOD)、200 μL(20 LOD)，同一浓度平行2份，按已确定的前处理方法和色谱质谱条件进行样品处理和测定，总数86.61%的农药测定结果回收率在80.00%～150.00%内；总数94.01%的农药相对标准偏差小于15.00%。

2.7 样品测定结果

根据以上建立的GC-MS/MS对105批栀子样品进行检测，结果见表4。所监测的56种农药中共检出14种，分别为氯氰菊酯、毒死蜱、甲氰菊脂、三唑磷、硫丹硫酸酯、氯氟氰菊酯、联苯菊酯、敌敌畏、氰戊菊酯、o,p′-DDT、p,p′-DDD、p,p′-DDT、p,p′-DDE和百菌清。氯氰菊酯检出范围为0.01～0.3 mg/kg，检出率为56.19%；毒死蜱检出范围为0.004～0.115 mg/kg，检出率为40.95%；甲氰菊脂检出范围为0.002～0.298 mg/kg，检出率为39.05%；三唑磷检出范围为0.004～0.15 mg/kg，检出率为30.48%。总体来看，105批样品中可检出农药的品种不多，检出量也大部分在限量范围内，但个别批次样品出现了农残超标的情况，特别是使用频率较高的氯氰菊酯、毒死蜱和甲氰菊酯等，存在安全性隐患。

表4 栀子中检出农药品种、批次、检出率及残留量结果范围

3 讨论

栀子适应性强，在我国大部分地区均有分布。栀子的野生及栽培品均常见，形成栽培规模的集中在华东和西南、中南等地区，其中以浙江、江苏、江西、湖北、湖南、四川、贵州等省份栽培较多。随着市场需求量不断增加，栀子的栽培面积和管理方法也在不断扩大和更新，据统计我国栀子的栽培面积达1.7万公顷，栽培过程中使用的种源及其他问题：①未经人为优选，种质资源不稳定;②从野生采种繁育等现象使得市面无良种可循，再反复的使用野生种源繁育后，栀子的抗逆性与野生相比明显降低;③栽培品种植过程中没有统一的管理方法使得各种疾病虫害也越发凸显[17-18]，因而在栽培过程中农药使用较为普遍。经调查发现，栀子的栽培管理较为混乱，农药使用没有标准化，对栀子的产量和质量的提升造成不良影响，药材的安全性问题不容忽视。本研究发现氯氰菊酯、毒死蜱、甲氰菊酯的检出率高于40.00%，三唑磷、硫丹硫酸酯和氯氟氰菊酯检出率大于10.00%，敌敌畏、戊菊酯、o,p′-DDT、p,p′-DDD和p,p′-DDT、p,p′-DDE和百菌清在105批样品中检出率小于5.00%。使用较为频繁的氯氰菊酯、甲氰菊酯、毒死蜱、三唑磷、硫丹硫酸酯、氯氟氰菊酯和联苯菊酯等被检出几率较大，同时农药残留量也较高，农残超标情况较为严重；敌敌畏、氰戊菊酯、o,p′-DDT、p,p′-DDD、p,p′-DDT、p,p′-DDE和百菌清几乎没有检出，残留量也均在规定范围内。推测可能为栀子生产种植过程中对检出率大于10.00%的农药品种使用更加频繁或用量更大，此类农药品种也是栀子农残检测中需要着重关注的部分，尤其对检出率和残留超标严重的氯氰菊酯、毒死蜱、加氰菊酯更应重点关注。本研究基于GC-MS/MS联用技术建立的农残快速检测方法为农残筛查提供了参考，其灵敏度高、专属性强、同时定性定量和检测效率高使得农残测定更为迅速、准确且便捷。本研究对市售的105批栀子样品进行检测发现所监测的57种农药中共检出14种，部分农药残留均在国家规定范围内，小部分批次样品出现了农残超标的情况。在栀子的种植与生产开发中，农药使用的不规范，使得个别农药超标，如能根据农残测定结果定向优化农药使用规范，可以为栀子的种植栽培提供一定的指导，以保证栀子的临床安全。