超声波结合酶法提取葡萄皮渣原花青素工艺优化及其抗氧化活性

2022-01-08 11:32王彦平陈月英孙瑞琳李东汤高奇吕全军
食品研究与开发 2021年24期
关键词:花青素超声波葡萄

王彦平,陈月英*,孙瑞琳,李东,汤高奇,吕全军

(1.河南农业职业学院,河南 郑州 451450;2.郑州大学,河南 郑州 451001)

原花青素(proanthocyanidins,PC)是由黄烷醇衍生而来的天然多酚类化合物,由不同数量的儿茶素或者表儿茶素结合而成,是一种天然抗氧化剂[1]。研究表明,原花青素具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降血糖、抗疲劳、抑菌消炎、预防老年痴呆和保护心血管等作用[2-8]。在葡萄酒和葡萄汁生产的过程中产生的葡萄皮渣,主要有葡萄梗、葡萄籽、葡萄皮和酒泥等物质。据文献报道,酿酒过程中产生的副产物葡萄皮渣中不仅含有花青素、原花青素,还含有包括单宁、酒石酸以及果胶等生物活性物质[9]。目前,葡萄皮渣一般被当做饲料、肥料,甚至被当做废料舍弃,其中所含有的多种有效成分未被利用,造成了环境污染和资源浪费。

原花青素的亲水性较好,易溶于多种有机溶剂中,如甲醇、乙醇、丙酮等。因此,原花青素的提取方法有很多,包括直接浸提法、有机溶剂提取法、超声波辅助提取法、酶提取法以及微波辅助提取法等[10-13]。其中有机溶剂提取法耗时较长且得率不够高,微波辅助提取容易使原花青素遭到破坏而使得率降低。而酶法提取利用纤维素酶使植物的细胞壁及细胞间质的纤维素、半纤维素等物质发生水解,从而有效促进活性成分地溶出。同时超声波辅助提取法可以通过空化效应、同热效应和机械效应破碎细胞,实现对生物活性物质的快速提取[13]。超声波辅助提取法和酶提取法在不同植物原料提取原花青素中均有所应用,然而,超声波结合酶法在原花青素提取的研究中并不多见,应用该技术提取酿酒葡萄皮渣中的原花青素的工艺报道较少。

本试验采用超声波结合酶法进行酿酒葡萄皮渣中原花青素的提取,研究纤维素酶添加量、酶解时间、酶解温度、超声时间、超声功率对原花青素提取的影响,在此基础上利用正交试验优化确定超声波结合酶法提取原花青素的最佳工艺参数,并测定其体外抗氧化活性,为葡萄皮渣的综合利用开辟新的途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2019年赤霞珠葡萄酿酒皮渣:河南省农业高新科技园。

1.2 材料与试剂

1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine,DPPH,纯度99%):美国 Sigma-Aldrich公司;原花青素标准品(纯度≥98%):上海源叶生物科技有限公司;纤维素酶(500 000 U/g):浙江一诺生物科技有限公司;无水乙醇、甲醛、香草醛、硫酸、双氧水、硫酸亚铁(均为分析纯):中国医药集团有限公司;一次性有机滤器(0.45 μm):南通市卫宁实验器材有限公司。

1.3 仪器与设备

GWB-1E实验室专用超纯水机、UV1901PCS双光束紫外可见光分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司;SCIENTZ-ⅡDM微波光波超声波萃取仪:宁波新芝有限公司;BSA423S-CW分析天平:德国赛多利斯集团;D5-R2离心机:湖南湘仪离心机仪器有限公司;202-3AB电热恒温鼓风干燥箱、HH-2数显恒温水浴锅:上海乔跃电子科技有限公司;RE2000旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂;L18-YJ08静音真空破壁机:杭州九阳生活电器有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 葡萄皮渣预处理

葡萄皮渣于45℃恒温箱烘48 h,破壁机粉碎后过50目筛,加入乙醚采用索氏抽提法进行脱脂处理,保存备用。

1.4.2 原花青素标准曲线的绘制

采用香草醛-硫酸法进行处理并实现对原花青素浓度的测定[12],将质量浓度(mg/mL)作为自变量,在500 nm处测定吸光度,并将吸光度A作为因变量进行线性回归分析,得到原花青素标准曲线,如图1所示。

图1 原花青素标准曲线Fig.1 Standard curve of procyanidins

原花青素标准曲线回归方程:y=0.931 0x+0.002 5,R2=0.999 1。说明原花青素在质量浓度为0.1 mg/mL~0.5 mg/mL的范围内有着良好的线性关系。

1.4.3 葡萄皮渣原花青素的提取

准确称取5.000 0 g葡萄皮渣粉于250 mL锥形瓶中,加入一定量纤维素酶和50 mL蒸馏水,在pH5.0和一定酶解温度条件下进行酶解反应,酶解后加入50 mL无水乙醇,放入超声波萃取仪,在一定功率下超声处理一定时间后,在75℃水浴中提取4 h。将处理过的提取液以6 000 r/min的速度进行离心,处理15 min之后取上清液进行减压蒸馏,再将其用95%的乙醇溶液定容至25 mL。

1.4.4 葡萄皮渣原花青素得率的测定

将处理之后的原花青素提取液先进行稀释处理,之后按1.4.2加入香草醛和硫酸对提取液进行处理,并测定吸光度A500nm。原花青素的得率计算公式如下所示。

式中:C表示溶液中原花青素的质量浓度,mg/mL;X用来表示稀释处理的倍数;V用来表示样品液体积,mL;m表示称取葡萄皮渣粉末的质量,g。

1.4.5 葡萄皮渣原花青素提取的单因素试验设计

1.4.5.1 纤维素酶添加量对原花青素得率的影响

按照1.4.3提取方法,在50℃条件下酶解120 min,用300 W的功率超声处理30 min,选择纤维素酶添加量分别为0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%,分析纤维素酶添加量对原花青素得率的影响。

1.4.5.2 酶解时间对原花青素得率的影响

按照1.4.3提取方法,纤维素酶的添加量为0.20%,酶解温度为50℃,用300 W的功率超声处理30 min,选择酶解时间分别为 30、60、90、120、150 min,分析酶解时间对原花青素得率的影响。

1.4.5.3 酶解温度对原花青素得率的影响

按照1.4.3提取方法,纤维素酶的添加量为0.20%,酶解120 min,用300 W的功率超声处理30 min,选择酶解温度分别为 35、40、45、50、55、60 ℃,分析酶解温度对原花青素得率的影响。

1.4.5.4 超声功率对原花青素得率的影响

按照1.4.3提取方法,纤维素酶的添加量为0.20%,在50℃条件下酶解120 min,超声处理30 min,选择超声功率分别为 100、150、200、250、300 W,分析超声功率对原花青素得率的影响。

1.4.5.5 超声时间对原花青素得率的影响

按照1.4.3提取方法,纤维素酶的添加量为0.20%,在50℃条件下酶解120 min,超声功率为300 W,选择超声时间分别为 10、20、30、40、50 min,分析超声时间对原花青素得率的影响。

1.4.6 葡萄皮渣原花青素提取工艺正交试验

在单因素试验的基础上,设计纤维素酶添加量、酶解时间、超声时间、超声功率四因素三水平L9(34)的正交试验,将不同条件下的原花青素得率作为正交试验的评价指标,以实现对超声波结合酶法工艺条件的优化,具体的正交试验因素及水平如表1所示。

表1 正交试验因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.5 抗氧化性测定

取最佳工艺条件下制得的葡萄皮渣原花青素提取液,参照文献 [14-16]的方法分别测定其总还原力、DPPH·清除率、·OH清除率,并以维生素C做阳性对照进行比较。

1.6 数据分析

试验结果均采用平均数±标准差表示,使用Microsoft Office Excel 2016和origin 9.0软件进行数据处理及图表制作。

2 结果与分析

2.1 葡萄皮渣原花青素提取工艺单因素试验

2.1.1 纤维素酶添加量对原花青素得率的影响

纤维素酶添加量对葡萄皮渣原花青素得率的影响如图2所示。

图2 纤维素酶添加量对原花青素得率的影响Fig.2 Effect of cellulose addition on procyanidins yield

由图2可知,随着纤维素酶添加量的不断增加,原花青素得率不断升高,当纤维素酶添加量为0.25%时原花青素得率达到最大;纤维素酶添加量继续增大到0.30%时,原花青素得率反而下降,可能是由于酶浓度过高时,底物浓度不能饱和,降低了酶作用效率[17]。故选择纤维素酶添加量0.20%、0.25%、0.30%做进一步优化。

2.1.2 酶解时间对葡萄皮渣原花青素得率的影响

酶解时间对葡萄皮渣原花青素得率的影响如图3所示。

图3 酶解时间对原花青素得率的影响Fig.3 Effect of enzymolysis time on procyanidins yield

从图3中可以看出,利用这种提取方式得到的原花青素得率先随着时间升高,到90 min时升高到最高点,此时原花青素得率达到最大。超过90 min得率开始逐渐下降,可能是由于随着酶解时间的进一步延长,溶出的原花青素被空气中的氧气氧化,或有其他杂质溶出,从而导致葡萄皮渣原花青素得率降低[18]。故选择酶解时间60、90、120 min做进一步优化。

2.1.3 酶解温度对葡萄皮渣原花青素得率的影响

酶解温度对葡萄皮渣原花青素得率的影响如图4所示。

图4 酶解温度对原花青素得率的影响Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on procyanidins yield

由图4可知酶解温度对提取试验中原花青素得率的影响,随着酶解温度升高原花青素的得率先升高后下降,而当酶解温度升高到55℃时,原花青素得率达到最大,而当酶解温度继续升高,酶的活性将受到酶解温度影响,酶解反应无法充分进行,原花青素得率也会有一定的下降,因此选择55℃为最佳酶解温度。

2.1.4 超声功率对葡萄皮渣原花青素得率的影响

超声功率对葡萄皮渣原花青素得率的影响如图5所示。

图5 超声功率对原花青素得率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic power on procyanidins yield

由图5可知超声功率对提取试验中原花青素得率的影响,随着超声功率增大原花青素的得率先升高后下降,当超声功率升高到250 W时,原花青素得率达到最大。而当功率继续升高,超声处理所带来的热效应可能会直接导致原花青素的降解,同时提取液的移动速度也会受到影响,导致原花青素溶出减少,得率降低[19]。故选择超声功率200、250、300 W做进一步优化。

2.1.5 超声时间对葡萄皮渣原花青素得率的影响

超声时间对葡萄皮渣原花青素得率的影响如图6所示。

图6 超声时间对原花青素得率的影响Fig.6 Effect of ultrasonic time on procyanidins yield

由图6可知,原花青素的得率随着超声时间的增加而升高,超声时间达到30 min时,原花青素得率最大。主要由于超声时间增加,葡萄皮渣细胞壁的破碎程度增加,原花青素得率逐渐升高,当达到一定时间后,可能会使原花青素结构发生改变,导致得率略下降[20]。故选择超声时间为25、30、35 min进一步优化。

2.2 葡萄皮渣原花青素提取工艺正交试验

葡萄皮渣原花青素提取正交试验结果如表2所示。

表2 葡萄皮渣原花青素提取的正交试验结果Table 2 The orthogonal experiment results of extracting procyanidins of grape pomace

由表2可知,可以通过对正交试验结果中的极差进行分析得到各因素对原花青素得率产生的影响,极差顺序为 RC>RB>RD>RA,各因素影响大小排序为超声时间>酶解时间>超声功率>纤维素酶添加量。对葡萄皮渣原花青素进行提取的最佳工艺为A3B2C2D2,即纤维素酶添加量0.30%、酶解时间90 min、超声功率200 W、超声时间30 min。为确定最佳提取工艺条件的稳定性和可靠性,按照此条件做验证试验,重复3次,此条件下葡萄皮渣原花青素得率为(14.22±1.13)mg/g,高于正交试验中所有试验结果,说明该工艺条件稳定可靠。

2.3 葡萄皮渣原花青素体外抗氧化活性

2.3.1 葡萄皮渣原花青素的总还原能力

葡萄皮渣原花青素的总还原能力如图7所示。

图7 葡萄皮渣原花青素的总还原能力Fig.7 Total reducing power of grape pomace procyanidins

由图7可知,随着葡萄皮渣原花青素质量浓度的增大,总还原能力逐步增强。在试验质量浓度范围内,葡萄皮渣原花青素总还原能力与质量浓度存在良好的剂量-效应关系,相同浓度下原花青素总还原能力强于维生素C。

2.3.2 葡萄皮渣原花青素对DPPH·的清除作用

葡萄皮渣原花青素对DPPH·的清除作用如图8所示。

图8 葡萄皮渣原花青素对DPPH·的清除作用Fig.8 DPPH·removal effect of grape pomace procyanidins

通过图8中的曲线可以发现,在试验的质量浓度范围内DPPH·的清除率和质量浓度成正比,也就是说葡萄皮渣原花青素的DPPH·清除能力对其浓度有较强的浓度依赖性,葡萄皮渣原花青素的浓度增加,对DPPH·的清除能力也相应增强。通过线性回归方程分析,葡萄皮渣原花青素对DPPH·的半数清除率IC50为0.130 mg/mL,而维生素C对DPPH·的半数清除率IC50为0.247 mg/mL,表明葡萄皮渣原花青素对DPPH·的清除能力显著优于维生素C。

2.3.3 葡萄皮渣原花青素对·OH的清除作用

葡萄皮渣原花青素对·OH的清除作用如图9所示。

图9 葡萄皮渣原花青素对·OH的清除作用Fig.9·OH removal effect of grape pomace procyanidins

通过图9中的曲线可以发现,在试验的质量浓度范围内对·OH的清除率和质量浓度成正比,质量浓度越大,对·OH的清除效果越好。通过线性回归方程分析,葡萄皮渣原花青素对·OH的半数清除率IC50为0.228 mg/mL,而维生素C对·OH的半数清除率IC50为0.375 mg/mL,说明葡萄皮渣原花青素对·OH的清除能力显著优于维生素C。

3 结论

试验表明,酿酒葡萄皮渣原花青素超声波结合酶法提取的最佳工艺条件为纤维素酶(500 000 U/g)添加量0.30%、酶解温度55℃、酶解时间90 min、超声功率400 W、超声时间30 min、75℃水浴中提取4 h,在此条件下,葡萄皮渣原花青素的得率为(14.22±1.13)mg/g。抗氧化试验表明,酿酒葡萄皮渣中原花青素的总还原能力、清除DPPH·和·OH的能力显著高于维生素C,因此葡萄皮渣原花青素具有良好的抗氧化活性。本试验的研究成果可应用于酿酒产业中,为实现工业化提取葡萄皮渣中原花青素提供理论支持,有较好的发展前景。

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