黄鳝出血病研究进展

文峥嵘，罗鸣钟，柴 毅，杨代勤，李 锐，魏 巍

（1.长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025；2.浙江省农业科学院农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室（筹），杭州 310021）

黄鳝（Monopterusalbus）因具有丰富的营养价值和较高的药用价值而深受广大消费者的青睐。近年来，养殖水体的污染以及不合理的养殖方式等导致黄鳝暴发性细菌疾病种类增多，给黄鳝养殖业造成巨大的经济损失。在黄鳝养殖中，出血病是暴发性细菌疾病之一，具有传染力强、死亡率高等特点［1］。嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）是水产养殖中暴发性细菌病的主要病原体之一［2］，是黄鳝出血病的主要病原菌［3］，嗜水气单胞菌为条件致病菌，其致病条件受菌体本身致病性和环境因素影响，环境突变时也会诱发黄鳝出血病。嗜水气单胞菌既可以单独引起黄鳝发病，也可与其他病原菌混合致病。本研究综述了嗜水气单胞菌在免疫学、病理学、分子生物学水平的研究进展，对其生物学特性进行了概括总结，旨在为有效防止黄鳝由嗜水气单胞菌引起的病害提供基础资料。

1 黄鳝出血病的病原及其特性

1.1 嗜水气单胞菌菌体形态

1989年，陈怀青等［4］从患病黄鳝体内分离病原菌培养，首次报道了黄鳝出血病病原为嗜水气单胞菌。培养发现嗜水气单胞菌菌体为革兰氏阴性菌，菌体直、两端钝圆、极生单鞭毛、有运动性，呈短杆形态。张锦华等［5］从发病的甲鱼（Pelodiscussinensis）中分离出一株细菌，感染黄鳝后黄鳝出现出血病症状，分离培养该菌株得到与嗜水气单胞菌菌体形态描述相一致。

1.2 嗜水气单胞菌菌落的形态特征

嗜水气单胞菌菌落直径2～3 mm，圆整平滑，有特殊芳香气味。颜色由白至浅黄色，在营养肉汤中，菌落大小因培养时间而异，在有氧环境及厌氧环境下，CAMP试验均为阳性［6］。杨移斌等［7］通过鉴别培养基的方法鉴别出一株从患病黄鳝体内分离到的病原菌株，培养发现试验菌落符合嗜水气单胞菌菌落相关描述，初步确定所获菌株为嗜水气单胞菌。

1.3 嗜水气单胞菌致病性

1891年，Sanarelli首次对嗜水气单胞菌形态结构进行描述，称为Bacillus hydrophila fuscus。1959年，中国科学院水生生物研究所研究报道嗜水气单胞菌能诱发鱼类烂鳃病和赤皮病。研究表明，通常通过表型变化、临床诊断以及基因的毒力因子成为致病性检测的标准［8］。高明辉等［9］从暴发细菌性出血病的发病黄鳝中分离得到了嗜水气单胞菌菌株，以5.0×108个/mL菌液浸浴黄鳝，菌液浸浴的黄鳝暴发出血病并在48 h死亡率达100%。莫豪虎等［10］将纯培养的嗜水气单胞菌以0.2 mL/条腹腔接种黄鳝，2 d内黄鳝均发病并死亡。可见嗜水气单胞菌对黄鳝有很强的致病性，浸浴或注射都能造成黄鳝死亡。

1.4 嗜水气单胞菌致病机理

嗜水气单胞菌可以通过饮水、皮肤创伤等途径感染，造成机体损伤［11］，鱼类的表皮是鱼类与水环境的第一道防线［12］。黄鳝患病途径主要是通过体表感染，首先嗜水气单胞菌会在鱼体表分泌体表外聚合物增加黏性，从而感染积聚繁衍［13］，破坏上皮组织，进入血液，然后通过血液循环进入肝脏、肾脏、脾脏等组织，继而引起组织以及血液变性，最后出现全身症状。

2 黄鳝出血病的病征及病理特征

黄鳝出血病在全国各地均有发生，湖北、湖南、江西、安徽等主产地大规模暴发，发病高峰期在8月下旬至10月上旬，流行季节为5—11月。黄鳝出血病主要病征表现为鱼体发白，黏液增多，烂肉烂鳍，肛门红肿，肠黏膜上皮脱落，基底膜排列紊乱，脾脏、腹腔等器官充血、出血，死亡率高［14］。何智［15］通过人工接种已鉴定的嗜水气单胞菌菌液到黄鳝体内，发现感染3 h后黄鳝肾脏病变最为明显，感染后期肠上皮细胞脱落、肝脏细胞坏死。凌天慧等［16］利用电镜观察发现，病鳝肝脏积血变性、组织溃烂，脾脏破裂、肾脏间质出血严重、少量肾小管消失以及肠组织细胞病变、肠系膜充血、伴有异常白细胞积聚。何智等［11］通过以3.6×107cfu/L菌液稀释10倍后腹腔注射健康黄鳝，嗜水气单胞菌胁迫后的黄鳝脾脏充血、出血、最终坏死，肝脏表现为细胞充血、形成空泡，肾脏最为严重，表现为肾小球坏死、间质充血、多组织坏死，肠道中肠组织病变、肠绒毛脱落。在嗜水气单胞菌感染黄鳝后，在组织病理变化明显，组织不同程度病变，伴随着器官大量出血，死亡率大大增高。

3 黄鳝出血病病原菌的诊断与检测

3.1 生化方法

黄鳝出血病病原的生化鉴定方法，通常包括菌体观察、人工感染、回归感染等常规鉴定方法。传统生化方法鉴定细菌种类主要依据细菌对营养物质分解能力不一致，代谢产物不同，致病性嗜水气单胞菌的检测已制定了国家标准GB/T 18652—2002［5］，即添加标准生化试剂到病鳝组织中观察反应结果，与国家标准进行对比发现便可得出初步结论。而后在生化反应的基础上研制出API快速反应板和细菌鉴定仪［17］，通过计算机分析不同测试孔的颜色变化来鉴定细菌的种属。高明辉等［9］通过传统生化试验，将从病体黄鳝的肝脏、消化道、血液分离到的单菌落接种生化管，经过生化分析鉴定，确定所采集致病菌为嗜水气单胞菌。

传统生化方法鉴定黄鳝嗜水气单胞菌的方式耗时耗力，使用AHM培养基鉴定菌株操作简单，但耗时较长；而全自动生物鉴定仪通过分析细菌图谱鉴定细菌更加精确可信，但机器较为昂贵，难以普及。

3.2 免疫学方法

斑点酶联免疫吸附试验（Dot-ELISA）利用硝酸纤维素膜（NCM）为载体，方法简便、节省抗原、保存期长。周飞等［18］应用斑点酶联免疫试验检测引起四川省绵阳市某养殖场暴发出血病的黄鳝病原，试验结果为阳性，即出现了明显棕色斑点，结合生化指标鉴定病原为嗜水气单胞菌，取得满意效果。

3.3 分子生物学方法

分子生物学技术广泛用于动、植物病原菌和病毒的相关检测方面，并体现了特异性强、灵敏度高、用时短、检测量大等优点［19］。

聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR），是一种在体外将特异性DNA进行引物介导的酶促放大方法。杨壮志等［20］根据气溶素基因序列，设计出一对特异性引物，采用PCR方法检测到致病性嗜水气单胞菌在17尾黄鳝中呈阳性表达，耗时6 h；相比常规鉴定耗时72 h，检出率仅为40.9%，PCR检测病原既快捷又准确。

多重PCR（multiplex PCR），是指在一个PCR体系基础上，添加两对及以上的引物进行扩增，最终得到多个DNA片段的PCR反应。艾克特等［21］将从患病黄鳝中获得的嗜水气单胞菌Hly A基因进行扩增，并建立多重PCR检测方法，检测出患病黄鳝的病原菌为嗜水气单胞菌以及肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）。多重PCR检测方法对水产常见病原鉴定有重要意义。

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），是一种合算恒温扩增技术，具有操作简便、灵敏度高等优点。喻蔚等［22］运用该技术扩增嗜水气单胞菌tbp A基因，优化反应温度，检测该方法的灵敏度及特异性，结果表明，该方法最适扩增时间为40 min，并且能有效检测到1 pg/μL核酸浓度，具有很高灵敏度及特异性，是快速检测嗜水气单胞菌的便捷方式。

分子生物学技术已经运用广泛，如基因组DNA的分离纯化、RNA的抽提、PCR的扩增等都是检测细菌及细胞的重要手段，运用分子生物学检测手段具有自动化程度高、速度快，同时便于建立标准化操作等优点。

4 黄鳝出血病病原菌研究进展

4.1 黄鳝免疫系统对嗜水气单胞菌侵染的应答机制

张钊等［23］对健康黄鳝注射不同浓度的嗜水气单胞菌菌液，通过定量PCR方式检测感染黄鳝的脾脏、肾脏和肌肉中Moronecidin基因在不同时间处理下的表达量。结果表明，Moronecidin基因在健康鱼体3种组织中都有表达，其中脾脏表达最高，随着浓度以及时间的升高，Moronecidin基因表达下调。林荣楠［24］通过荧光定量PCR反应，检测黄鳝MIF和CathepsinB两个基因在感染嗜水气单胞菌后的表达变化，表明感染后的黄鳝MIF基因表达量呈先高后低的趋势；黄鳝CathepsinB基因表达量明显升高，即黄鳝MIF和CathepsinB基因对黄鳝抵御嗜水气单胞菌入侵有积极作用。阚延泽等［25］利用荧光定量PCR对黄鳝载脂蛋白A1基因在不同组织以及嗜水气单胞菌胁迫后的表达情况进行了分析，表明该基因在不同组织中均有表达，其中肝脏中最高，黄鳝的载脂蛋白Apo-A1基因可能参与了鱼体的天然免疫反应。在鱼类中，TNF-α和IL-1β是两种广泛研究的细胞因子［26］，Xu等［27］通过Real Time PT-PCR方法检测IL-1β和IL-1R2在不同组织的表达情况，注射6 h后基因表达量达到最高水平，表明IL-1β和IL-1R2在炎症和宿主防御中起重要作用。当嗜水气单胞菌侵入机体时会引起黄鳝发生免疫应答，通过PCR检测免疫基因的表达变化，判定嗜水气单胞菌对黄鳝免疫基因的影响。

鱼类非特异性免疫是通过各种免疫细胞和免疫因子来实现的［28］。嗜水气单胞菌侵入时会诱发黄鳝发生非特异性免疫，刺激机体的氧化应激，产生大量的活性氧，酶促可以减少氧化应激带来的损伤，同时反应机体受损伤程度［29］。溶菌酶、碱性磷酸酶、谷胱甘肽S-转移酶、酸性磷酸酶和超氧化物歧化酶是机体内重要的免疫因子［30］，溶菌酶是目前研究最多的先天反应因子［31］，负责补体系统的激活和吞噬病原的作用［32］，这几种酶类都能反映黄鳝免疫功能的变化，张钊等［23］通过检测病鳝血清中溶菌酶、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、总超氧化物歧化酶4种酶活性变化，4种酶活性呈现先升高后降低的趋势。王霞等［33］用不同浓度嗜水气单胞菌感染健康黄鳝，研究细菌对黄鳝血细胞的影响，表明感染24 h的黄鳝红细胞浓度随着处理组菌浓度增加而逐渐减小，感染后黄鳝白细胞及淋巴细胞显著增多，说明嗜水气单胞菌会刺激机体产生免疫反应，感染前期免疫酶活以及炎症细胞增多产生免疫应激，感染后期由于嗜水气单胞菌的致病性导致免疫因子的活力逐渐降低，从而影响黄鳝的免疫功能表达。可见，嗜水气单胞菌可以影响黄鳝机体多种酶类以及免疫细胞应激，降低机体免疫力。

4.2 抗菌肽对嗜水气单胞菌的抑菌作用

抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs），是非特异性免疫的重要组成成分［34］，免疫性好，具有广谱杀菌功能，在黄鳝机体各组织均有分布。许勤智［35］从黄鳝血液、表皮、体表黏液、肝脏、脾脏、肠道和肾脏等组织中提取到了抗菌肽粗提物，表明黄鳝肠道的抗菌肽提取物对嗜水气单胞菌的抑制效果最好。王霞［36］研究黄鳝肝脏、肾脏、肠和皮肤提取物的抗菌活性，表明4种组织的提取物都对嗜水气单胞菌具有很好的抑制作用。李联泰等［37］将黄鳝体表黏液分离纯化，得到多肽MAS-Ⅳ-4，抑菌试验表明MAS-Ⅳ-4对嗜水气单胞菌有较强的抑菌效果。唐勇［38］将黄鳝肝脏和肠道粗提取物进行纯化，获得黄鳝抗菌肽，抑菌试验表明获得的抗菌肽对嗜水气单胞菌有很好的抑制效果。黄鳝抗菌肽作为黄鳝体内外广泛存在的一类杀菌剂，是病原入侵机体时的一道屏障，其广泛的生物学活性显示其在生物免疫上良好的应用前景。

5 黄鳝出血病的防治

5.1 抗生素

使用抗生素防控嗜水气细胞单菌引发的黄鳝疾病，能在短时间内控制病情蔓延，但高频率使用抗生素带来的负面影响也十分显著。抗生素具有高水溶性，因在环境中不易降解［39］，在养殖生产中盲目使用抗生素，会造成环境污染及防治效果降低等问题。抗生素在生产上运用广泛且价格低廉，操作简单（表1）。

表1 抗生素对黄鳝源嗜水气单胞菌药敏试验的相关研究

抗生素在治疗黄鳝出血病，抵抗嗜水气单胞菌侵袭方面拥有很好的效果，能够有效防治黄鳝出血病。但各地黄鳝源分离的嗜水气单胞菌菌株对抗生素的敏感程度存在差异，产生该现象的原因较多，如菌株分离地点环境差异产生了耐药性的变异；药敏试验所用的药物浓度以及敏感性判断标准不同；黄鳝养殖过程中抗生素药物的使用不规范导致耐药菌株的产生等。抗生素的使用有利有弊，选用抗生素防治黄鳝出血病时应根据实际情况进行选择，并注意用药量。

5.2 中药

中药可以减少甚至替代抗生素的使用，防治黄鳝源嗜水气单胞菌引起的疾病［2］，植物提取物是替代抗生素很好的免疫刺激剂［44］，药用植物具有抗氧化特性，减少机体损伤［45］。国内学者们已进行了大量研究（表2）。

表2 中药防治黄鳝出血病的相关研究

中药防治黄鳝嗜水气单胞菌研究主要分为体外抑菌试验、养殖投喂试验和腹腔注射试验。体外抑菌是通过培养基抑菌试验，运用纸片法检测目的中药对嗜水气单胞菌的影响效果。卢春霞［46］通过醇提法获得16种中草药；孙武等［47］通过浸提法制成复方渔用药；周飞等［22］通过水提法获得12味中草药，表明调整投喂可提高黄鳝免疫力。养殖投喂试验更加贴近生产实践，则更加直观地体现中草药制剂的效果［48，49］。4种复方中草药在提高黄鳝存活率和降低疾病发生方面都有促进作用。通过腹腔注射中草药防治疾病黄鳝出血病发生的方式，在生产运用中推广难度更大、操作要求更高。闫琳等［50］通过将加味玉屏风散腹腔注射黄鳝，相比对照组提高了黄鳝的存活率。研究证明植物化学物质对嗜水气单胞菌具有很好的抑菌活性［51］。中药防治黄鳝出血病疗效良好，对环境的污染小，但由于所需治疗时间长，需要长期防治才有很好的效果，投入的物力人力较大，并且治疗效果也会因为环境的改变发生变化，防治效果不一，想要推广中药防治黄鳝出血病还需进一步研究。

5.3 全菌灭活苗

全菌灭活疫苗安全性高、成本较低，但存在免疫效果不理想、免疫持久性不佳等问题。范红结等［52］选用嗜水气单胞菌疫苗生产用菌J-1株，制成灭活疫苗以腹腔注射和浸泡方法免疫黄鳝，后用同源强毒力株攻毒，疫苗的相对存活率分别为83.3%和58.3%。该疫苗能为黄鳝提供一定的保护，在一定程度上能有效防止疫病的传播。

5.4 养殖管理

黄鳝出血病发生是黄鳝、致病菌和水环境多因素联合作用的结果，其中水环境因素具多变性，是决定疾病发生和发展的重要外部因素，嗜水气单胞菌的致病性为该病发生的内部因素，研究发现嗜水气单胞菌主要通过细胞外产物和独立因子发挥致病性［53］。黄鳝养殖管理是疾病防治中的关键环节，病害防治以预防为主。使用消毒剂来预防疾病发生，聚维酮碘（PVP-I）是一种广谱消毒剂，对多种病原都有很好的杀灭效果［54］。Chen等［55］利用聚维酮碘在不同类型的水中进行消毒，证明聚维酮碘可以有效地防止嗜水气单胞菌在黄鳝养殖中的传播，减少黄鳝出血病的发生，提高生存率。生产中也通过投喂酵母免疫增强剂来提高黄鳝的抗病能力，徐海华等［56］通过投喂不同浓度免疫多糖（酵母细胞壁）到黄鳝饲料中，研究免疫多糖对受嗜水气单胞菌感染的黄鳝非特异性免疫及特异性免疫的影响，表明免疫多糖有效地提高了黄鳝的免疫能力，同时提高了黄鳝对嗜水气单胞菌的抵抗力。

6 结论

嗜水气单胞菌是多种水生生物的原发性致病病原菌，同时也是能引起人、兽、水生动物患病的一类病原菌［6］。随着科技的进步，嗜水气单胞菌的鉴定方式已经趋于规范，并制订了国家标准。但到目前针对黄鳝出血病的防控方式各有利弊。首先，嗜水气单胞菌的致病性会因环境不同而发生变化，针对嗜水气单胞菌疫苗的开发进行了大量的研究，但有关黄鳝源嗜水气单胞菌的疫苗研发还比较薄弱；其次，生产养殖上多采用抗生素防治嗜水气单胞菌引起的疾病，既容易产生耐药性，又对生态环境有一定的危害，因此对于抗生素的污染、中药防治效果的稳定性、疫苗价格昂贵等问题亟待解决。在运用分子生物学方法研究黄鳝出血病方面，对于嗜水气单胞菌的作用机制尚未研究清楚，对于其毒力因子的研究还不够充分，对于嗜水气单胞菌的分布、来源、感染途径、在体内的作用机理没有宏观的描述。同时，抗菌肽的研发又具有产量低、费时、价格高昂、制作工艺要求高、无法实现大规模规范化生产等限制因素。由于嗜水气单胞菌主要通过肠道感染，学者们开始探索有益菌对防治黄鳝出血病的免疫效果，研究已证实细菌素和乳酸对嗜水气单胞菌具有协同抑制效果［57］，从生物膜探讨对嗜水气单胞菌的抑制，给黄鳝出血病防治提供了新思路，还有通过肠道菌群的多样性提取出优质的益生元、益生菌在鱼体内起到很好的免疫保护作用［58］。至此，为更加有效地防治黄鳝出血病，建议增加黄鳝肠道微生物稳态方面的研究，同时研发更易代谢和少污染的抗生素药品，疫苗和抗菌肽方面着重于市场的需求度方面靠拢，研制价格低廉、防控效果好、免疫方式便捷同时能够大规模生产的新型疫苗及抗菌肽。