GRIN1在脑胶质瘤中的表达及其临床意义

张化明 张 华 魏 恒

胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤，即使采用手术联合术后放/化疗等综合治疗，效果仍不理想。基因治疗有望成为胶质瘤的治疗方法之一，但目前仍缺乏理想可靠的治疗靶标。谷氨酸受体亚基1（glutamate ionotropic receptor type subunit 1，GRIN1）是离子型谷氨酸受体中的一类亚基，两个GRIN1亚基和两个GRIN2亚基组成的N-甲基-D-天冬氨酸受体在谷氨酸系统中起着重要的作用[1]。目前研究发现GRIN1 的表达异常与多种恶性肿瘤（如肺癌、乳腺癌、喉癌、胃癌）的发生、发展相关[2～4]。本文探讨GRIN1在脑胶质瘤中的表达及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 生物信息学分析 计算机检索CGGA 数据库（http://www.cgga.org.cn/index.jsp）、GEPIA 数 据 库（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html），下载脑胶质瘤基因表达谱数据和对应的临床数据。CGGA 数据库下载321 例脑胶质瘤样本数据，GEPIA 数据库下载163 例胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）、518 例低级别胶质瘤（low-grade glioma，LGG）、207 例正常脑组织样本数据。采用生信分析方法分析不同组织GRIN1表达变化及其与胶质瘤病人预后的关系。

1.2 胶质瘤组织标本的采集 收集2017 年1 月至2020 年12 月手术切除脑胶质瘤标本67 例，其中男38 例，女29 例；年龄48～73 岁。WHO 分级Ⅱ级23例，其中男13 例，女10 例；平均年龄（59.32±9.25）岁。WHO分级Ⅲ级18例，其中男10例，女8例；平均年龄（58.48±8.43）岁。WHO 分级Ⅳ级26 例，其中男15例，女11例；年龄（57.48±8.78）岁。另收集颅脑损伤内减压术切除的非肿瘤脑组织标本10 例作为对照，其中男6 例，女4 例；平均年龄（60.23±9.57）岁。

1.3 免疫组化染色检测GRIN1 的表达 常规石蜡包埋，4 μm厚切片。经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、洗脱二甲苯，再用3%过氧化氢溶液灭活内源性过氧化物酶，随后用山羊血清封闭。滴加兔抗人GRIN1 单克隆抗体（1:200；美国Abcam 公司），4 ℃摇床孵育12 h，室温孵育30 min，PBS 洗涤5 min×3 次；加稀释的二抗（1:100；美国Beyotime 公司）37 ℃孵育1 h，PBS 洗涤5 min×3 次；DAB 显色，显微镜下观察显色效果，自来水终止显色，苏木素染液衬染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。显微镜下每张切片观察5 个视野，每个高倍镜至少观察100 个细胞（图1）。参考文献[5]报道方法采用染色细胞百分比结合染色程度判读，两位病理科医师采用双盲法观察。染色程度评分（以阴性着色、淡黄色、黄色、深黄色分别计0、1、2、3 分）、染色细胞百分比评分（1%～25%为1分；26%～50%为2分；＞50%为3分）。最终将分数相乘，得出GRIN1 表达评分，0～3 分为低表达，4～9分为高表达。

图1 胶质瘤GRIN1表达水平的生信分析

图1 免疫组化染色检测GRIN1的表达

1.4 术后随访 随访截止2021年8月1日或者病人死亡，包括门诊、电话随访等，记录生存、死亡情况。

1.5 统计学分析 应用SPSS 25.0软件进行分析；计量资料以±s表示，采用t检验；计数资料采用χ2检验；采用多因素Cox比例回归风险模型分析死亡的危险因素；采用Kaplan-Meier 曲线分析GRIN1 表达水平与胶质瘤病人生存期的关系；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生信分析结果 与正常脑组织相比，GBM和LGG组织GRIN1 表达水平明显降低（P＜0.001，图2A）；而且，GRIN1 表达水平随胶质瘤病理级别增高而明显降低（P＜0.001，图2B）。GRIN1高表达组胶质瘤病人中位生存期较低表达组明显缩短（P＜0.0001，图3）。2.2 67例胶质瘤分析结果 非肿瘤脑组织、Ⅱ级胶质瘤、Ⅲ级胶质瘤、Ⅳ级胶质瘤GRIN1低表达率分别为0%、21.7%（5/23）、72.2%（13/18）、73.1%（19/26），随胶质瘤病理级别增高，GRIN1表达水平明显降低（P＜0.05）。单因素分析结果显示，WHO分级、肿瘤直径、肿瘤切除程度、GRIN1 表达水平与病人生存预后有关（P＜0.05，表1）。多因素Cox比例回归风险模型分析结果显示，肿瘤未全切除、GRIN1低表达是脑胶质瘤生存预后不良的独立危险因素（P＜0.05，表2）。生存曲线分析显示，GRIN1 低表达组胶质瘤病人中位生存期较高表达组明显缩短（P＜0.05，图3）。

表1 本文67例胶质瘤预后影响因素的单因素分析

表2 本文67例胶质瘤预后影响因素的多因素Cox回归分析

图2 GRIN1表达水平与胶质瘤病人预后的关系

图3 生存曲线分析GRIN1 表达水平与胶质瘤病人生存预后的关系

3 讨论

胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤，特别是GBM，恶性程度高，预后差。胶质瘤的发生、发展涉及多个基因的异常表达，因此，分析胶质瘤发生和预后的影响因素具有重要的临床意义。本文发现胶质瘤GRIN1呈低表达，增加胶质瘤病人死亡的风险。

GRIN1 是N-甲基-D-天冬氨酸受体的一类亚基。N-甲基-D-天冬氨酸受体由两个GRIN1亚基与两个GRIN2 亚基共同组成。GRIN1 是所有功能性N-甲基-D-天冬氨酸受体的必需亚基，在神经元中广泛表达[6]。GRIN1 可以通过调控配体门控离子通道（例如钾、钠和钙离子的交换），调控N-甲基-D-天冬氨酸受体通道，在神经元发育、生存等过程中起重要的作用。GRIN1 亚基最重要的作用是降低N-甲基-D-天冬氨酸受体激动剂的效力，防止N-甲基-D-天冬氨酸受体通道的过度激活[7，8]。因此，当GRIN1 表达降低时，N-甲基-D-天冬氨酸受体功能过度激活，可通过一系列下游通道的激活，引起相应的生理病理变化。同时，GRIN1 可以和GRIN2 竞争激动剂或拮抗剂的结合位点，影响N-甲基-D-天冬氨酸受体的功能[9]。

钙调蛋白、钙调蛋白依赖性蛋白激酶可与包括GRIN1 在内的多种谷氨酸受体相互作用，促进胶质细胞向胶质瘤细胞的转化，提示GRIN1 参与胶质瘤的发生过程[10]。N-甲基-D-天冬氨酸受体的激活可增加细胞内钙离子浓度，减轻氧化应激，调节谷氨酸代谢[11]。N-甲基-D-天冬氨酸受体的激活不仅有助于神经胶质增殖和星形胶质细胞增生[12]，而且还调节其侵袭和分化能力[13]。细胞内Ca2+水平的快速增加和细胞内信号传导的加快，激活N-甲基-D-天冬氨酸受体，促进细胞分裂、分化和细胞内修饰[14]。此外，研究表明细胞内钙浓度的增加激活N-甲基-D-天冬氨酸受体后可以通过激活丝氨酸/苏氨酸激酶通路促进胶质瘤细胞增殖和侵袭[15]，还可以激活细胞外调节蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶通路[16]和蛋白激酶A通路[17]，促进脑胶质瘤进展。

综上所述，脑胶质瘤GRIN1呈低表达，与病人的不良预后相关，可作为胶质瘤预后的预测因子。