虾夷扇贝HSP90 基因克隆及组织表达分析

严俊丽，张广明，吴 彪，孙秀俊，石 英，李学丽，王 强，刘建胜，孔垂民

（1.山东畜牧兽医职业学院动物科技学院，山东潍坊 261000；2.潍坊海洋科技职业学院海洋生物学院，山东潍坊 261000；3.潍坊科技学院招生就业处，山东潍坊 261000；4.农业部海洋渔业可持续发展重点试验室，中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛 266071）

虾夷扇贝Mizuhopecten yessoensis 隶属于软体动物门Mollusca、瓣鳃纲Lamellibranchia、翼形亚纲Pterimorphia、珍珠贝目Pterioida、扇贝科Pectinidae、虾夷扇贝属Mizuhopecten[1]。原产于俄罗斯千岛群岛南部、日本北海道和本州北部以及朝鲜半岛东部海域，属于冷水性双壳贝类[2]。其肉质鲜美，营养丰富，经济价值高，受到广大养殖户和消费者一致好评[3]。自20 世纪80 年代从日本引入我国开展人工育苗和增养殖以来，虾夷扇贝迅速在我国黄海北部和山东半岛北部部分沿海形成产业规模[4]。近年来，虾夷扇贝夏季高温死亡给养殖户带来巨大经济损失的同时，一定程度上制约了我国扇贝养殖业的健康发展[5]。探讨虾夷扇贝的高温应激机理，旨为解决高温死亡问题打下坚实的基础。

热休克蛋白（heat shock protein，HSPs）是高度保守的应激蛋白，在生物体应对高温、缺氧、有机物污染和病原体侵染等环境胁迫时发生作用[6]。正常生理状态下，HSPs 作为分子伴侣和不同的多肽链非特异性结合催化介导蛋白质特定构象的形成，表达量较少；出现环境胁迫时，其表达量激增帮助生物体免受伤害[7]。HSPs 家族种类较多，根据分子量大小分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40 和小分子热休克蛋白等类型[8]。

HSP90 作为HSPs 家族中重要的成员之一，在多种生物体内均有表达，除了行使分子伴侣的功能外，还参与机体信号传导、细胞周期及免疫调节，对于维持内环境稳态具有重要作用[9]。目前，HSP90 已成为细胞免疫、内环境稳态、信号转导及肿瘤研究的前沿课题。关于软体动物HSP90 的研究主要有：魁蚶Scapharca broughtonii[10]、三角帆蚌Hyriopsis cumingii[11]、独角雪冰鱼Chionodraco hamatus 和伯氏肩孔南极鱼Trematomus bernacchii[12]、近江牡蛎Craassostrea hongkongensis[13]、厚壳贻贝Mytilus edulis[14]、海湾扇贝Argopecten irradians[15]。然而，关于虾夷扇贝HSP90 基因（命名为MYHSP90）的相关研究未见报道。

本试验从虾夷扇贝转录组文库中鉴定出HSP90 基因的UniGene 序列，利用RACE 技术克隆了该基因的cDNA 全长序列；分析其核酸、氨基酸序列及蛋白结构；利用qRT-PCR 技术检测分析其组织分布特点，以期为虾夷扇贝的免疫研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品来源

试验用虾夷扇贝（壳长70 mm 左右）取自青岛市胶南海区，试验室条件下暂养充气海水中1 周（20 ℃），每日换水2 次，期间投喂硅藻，试验前2 天停止投喂。

1.2 MYHSP90 基因全长cDNA 的获得

1.2.1 RNA 提取和cDNA 合成异硫氰酸胍法提取总RNA，详细方法参照文献[16]。1.2%琼脂糖检测总RNA 完整性，核酸分析仪BioPhotometer D30（Eppendorf）检测RNA 的纯度与浓度。

1.2.1.1 RACE 模板的制备

根据SMARTerTMRACE cDNAAmplication Kit 说明书分别合成5’-RACE-Ready cDNA 和3’-RACEReady cDNA。

1.2.1.2 cDNA 克隆测序及序列分析

根据本实验室建立EST 转录组文库，利用Primer primer 5.0 及Oligo 6.0 软件设计RACE 特异性引物MYHSP90-F/R。RACE 扩增体系为30 μL：cDNA 模板1 μL，dNTP Mixture（each 2.5 mmol·L-1）4 μL，MYHSP90-F 1 μL，MYHSP90-R 1 μL，10×LA PCR bufferⅡ（Mg2+Plus）3 μL，TaKaRa LA Taq（5 U·μL-1）0.3 μL，灭菌ddH2O 19.7 μL。扩增反应条件：94 ℃，1 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，2 min，35 个循环；72 ℃，10 min；4 ℃保存。巢式PCR 利用NUP 和巢式引物进行扩增。PCR 产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，用MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit（TaKaRa）回收，胶回收产物与pMD18-T 连接，亚克隆至Escherich coli Top10 感受态细胞，并挑阳性克隆进行测序。

序列分析DNAStar 软件对cDNA 序列的开放阅读框进行搜索、氨基酸预测；ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）预测HSP90 蛋白的分子量（Mw）及等电点pI；SignalIP 4.0Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测HSP90 蛋白N 端信号肽;SMART（http://www.expasy.ch/SMART）预测分析HSP90 蛋白功能域；BLASTp（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）在线对HSP90 核苷酸序列进行同源检索分析；MEGA 5.0 构建基于不同物种HSP90 氨基酸序列的系统发育树。

1.3 MYHSP90 组织分布

1.3.1 组织取样

随机取3 个个体，活体解剖取上外套膜、下外套膜、肝胰腺、大闭壳肌、小闭壳肌、斧足、鳃、性腺，立即置于液氮中，将同一组织混合研磨提取RNA。

1.3.2 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

根据定量引物设计原则,Primer Premier 5.0 设计定量引物Q-F/R，选取β-actin 基因作为内参基因[16]。qRT-PCR 扩增（ABI 7500 PCR 仪）体系为：SYBRPremix EX Taq TM Ⅱ10 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4 μL，Q-F/R 0.8 μL，cDNA 2 μL，灭菌ddH2O 6 μL。反应条件为：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，34 s，40个循环。

1.3.3 数据分析

得到的数据采用2-△△CT方法[17]进行分析，获得基因的相对表达量。采用SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析，当P＜0.05 为存在显著性差异，P＜0.01 为存在极显著性差异。

表1 MYHSP90 扩增所用引物序列Tab.1 The primers used in the cloning of MYHSP90

2 结果

2.1 MYHSP90 基因的cDNA 序列分析

将扩增并测序的5’-RACE、3’-RACE 序列及已知序列拼接后得到虾夷扇贝的HSP90 基因的cDNA全长序列，命名为MYHSP90（GenBankAccssion No.MW175520）。MYHSP90 基因的cDNA 全长2 524 bp：开放阅读框（ORF）2 181 bp，5’-非编码区（5’-UTR）67 bp，3’-非编码区（3’-UTR）325bp。该基因编码一个由726 个氨基酸组成的蛋白质，预测蛋白分子量为83.21 kDa，理论等电点pI 为4.81，具有5 个保守的HSP90 蛋白功能域家族序列标签：FLRELISNASSDALDKIR（260-311），LGTIAKSGT（450-475），IGQFGVGFYSAYLVAD（522-567），IKLYVRRVFI（1 203-1 229），GVVDSEDLPLNISRE（1 278-1 322）。结构特征分析结果表明：该氨基酸序列无信号肽，也非线粒体靶向肽，无明显的跨膜区域；该蛋白具有多个功能化位点，第233 位有表皮生长因子受体磷酸化位点；第242 位有丙氨酸脱氢酶磷酸化位点；第393 位有丝氨酸蛋白酶磷酸化位点；第1 160 位有DNA 裂解酶铁-硫结合结构域磷酸化位点。C 末端存在保守的MEEVD多肽结构。图1 为MYHSP90 的预测三级结构，图2 为核苷酸序列和相对应的氨基酸序列。

图1 MYHSP90 预测的三级结构Fig.1 The modeled tertiary structures of MYHSP90

图2 MYHSP90 核苷酸序列及相对应的氨基酸序列Fig.2 The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of MYHSP90

2.2 MYHSP90 同源性分析

在线BLASTp 同源性分析结果如图3 所示，MYHSP90 编码的氨基酸序列与其它物种编码的氨基酸序列同源性很大。与栉孔扇贝C.farreri 相似性最高，为92.3%，海湾扇贝A.irradiaas 为86.5%，缢蛏S.constricta 为81.9%，近江牡蛎C.hongkongensis 为79.9%，魁蚶S.broughtonii 为79.1%。

DNAman 8.0 对15 个物种的HSP90 的氨基酸序列进行比对，HSP90 的氨基酸序列高度保守，HSP90家族的5 个签名序列和C 端的MEEVD 短肽序列也极其保守。

Mega 5.0 软件以邻位相接法（Neighbor-joining 法），构建了HSP90 氨基酸的进化树，结构如图4 所示，在HSP90 分子进化树中可以看到脊椎动物和无脊椎动物分为2 支，在无脊椎动物中，MYHSP90 双壳类HSP90 分子聚类后再与斧足类HSP90 聚在一起。

图4 HSP90 的Neighbour-Joining 系统发育树Fig.4 The phylogenetic tree of HSP90s

2.3 MYHSP90 基因的组织表达

qRT-PCR 检测的组织分布结果显示（图5），MYHSP90 分布于虾夷扇贝外套膜、肝胰腺、斧足、鳃、性腺中。性腺和肝胰腺中的基因表达量差异极显著，且在各组织中表达量差异极显著，其中在性腺中表达量最高，在性腺中表达量次之。

图5 虾夷扇贝MYHP90 的组织表达Fig.5 The tissue expression of MYHP90

3 讨论

本文以虾夷扇贝转录组文库中注释得到的Uni-Gene 为基础，克隆得到HSP90 基因全长序列，并分析其氨基酸序列。MYHSP90 基因全长2 524 bp，ORF 为2 181 bp，编码了726 个氨基酸。魁蚶S.broughtonii 的HSP90 基因全长2 707 bp，ORF 为2 187 bp，编码了728 个氨基酸[16]。大黄鱼HSP90 基因全长2 715 bp，ORF为2 178 bp，编码了725 个氨基酸[18]。独角雪冰鱼C.hamatus ORF 为2 184 bp，编码了728 个氨基酸，尼罗罗非鱼O.niloticus ORF 为2 175 bp，编码了725 个氨基酸[12]。这表明海洋生物HSP90 基因大小相当，氨基酸数量相差不大，氨基酸序列的保守性推测可能具有高等动物HSP90 相同的功能和活性。

HSP90 作为真核生物体内重要的分子伴侣，广泛介导了胁迫信号的传递，在细胞免疫、信号转导以及抗肿瘤研究较多[19]。同时因其高度保守性，被广泛应用于分子进化和分子系统学研究[20-21]，在极端的温度适应中也发挥着重要的作用[22-23]。温度胁迫时，HSP90 表达量有明显变化[24-25]。低温（0.5 ℃）和高温（25 ℃）分别胁迫中国大鲵A.davidianus，发现低温时在肠道、胰腺和胃中HSP90 表达量下调，高温时上调[26]。温度胁迫刺参A.japonicus，HSP90 的表达量在不同组织中也呈现显著性差异[27]。正常生理状态下的虾夷扇贝，HSP90 基因的表达具有组织特异性，在性腺、肝胰腺和鳃中表达量较高，且在性腺中的表达量明显高于其它组织，这一结果和近江牡蛎C.hongkongensis 中的表达量相似[28]，推测产生这一现象的原因是HSP90 有阻断凋亡酶激活因子Apaf-1寡聚糖化，阻断凋亡体形成的作用[29]，而性腺中可溶性蛋白、多肽的种类较其他组织更为丰富[30-33]，推测在虾夷扇贝体内，性腺承担了重要免疫器官的作用，可能参与了蛋白质和酶类分子的合成、应激反应等过程。当温度胁迫三角帆蚌H.cumingii 时，HSP90 表达量最高的器官分别是肝胰腺和性腺，得到了类似的结果[11]。分析HSPs家族的其它基因在虾夷扇贝的表达情况，正常温度下HSP60 在肝胰腺和肾脏中表达量最高，升温后在肾脏中表达量极显著，而HSP70 在鳃组织中的表达量明显高于闭壳肌和外套膜中[34]。关于HSPs 家族的成员在虾夷扇贝的不同组织中呈差异性表达的原因，将在接下来的工作中进一步研究。

热胁迫对生物体的影响较大。日本三角涡虫Freshwater planarian dugesia japonica 由18 ℃升高至30 ℃，热处理48 h，HSP70 表达量是对照组的2 倍[35]。温度的一次效应、二次效应对马氏珠母贝鳃HSP70 基因表达量影响显著[36]。热胁迫下，机体的消化功能、免疫功能、生长、行为、神经内分泌等方面受影响明显，主要原因在于热胁迫影响细胞内自由基的稳定性，导致细胞内线粒体氧化损伤，从而引起脂肪、蛋白质、糖类资源的重新整合[37]。高温胁迫菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum，鳃中HSP90 基因表达量在6 h 达到最高表达量[38]。37 ℃热激厚壳贻贝，肝胰腺和鳃中HSP70 基因表达量在2 h 即达到对照组的30 倍[14]。试验结果可为研究虾夷扇贝HSP90 基因上调表达，维持内环境稳态，以及探讨因地理分布和异地增养殖的功能适应提供理论依据。

4 结论

本研究采用RACE 技术克隆获得虾夷扇贝热休克蛋白90（HSP90）基因cDNA 全长序列。并分析了核苷酸、氨基酸序列，蛋白结构域特点，并做了同源性分析和系统进化研究。qRT-PCR 结果表明，MYHSP90基因在虾夷扇贝8 种组织中均有表达，性腺中表达量最高，而闭壳肌中表达量最低。