6种常绿冬青叶片解剖结构与抗寒性的关系

王小彬，种雪薇，刘 岗，耿煜然，刘富坤，于晓艳*

(1.山东农业大学林学院，山东 泰安271018；2.山东瀚林苑生态科技有限公司，山东 威海264500；3.泰安市城市管理局园林绿化处，山东 泰安271018；4.乳山市夏村镇农业综合服务中心，山东 威海264500)

冬青属（Ilex）常绿树种资源丰富，叶片四季常绿，树型多姿优美，果实艳丽光亮、经冬不落，观赏价值极高，具有广阔的开发应用前景。目前，国外培育出的常绿冬青品种已达1000 余个，以绿篱、行道树、景观树、模纹花坛、花境等多种方式广泛应用于道路、公园、庭院等园林绿地中[1]。但我国的常绿冬青引种栽培工作仍处于刚起步阶段，且引种栽培地主要集中于江苏及江苏以南地区。冬季低温是限制其继续“北引”的关键因子。所以，建立科学的抗寒评价体系，从众多的常绿冬青里筛选出可在北方高寒地区栽培的种或品种，对改善我国北方冬季园林景观萧条现状具有重要意义。

近年来，常绿冬青的抗寒性评价引起了很多研究者的关注。曾雯等[2]、张纪林等[3]、崔莺文等[4]、柴弋霞等[5]和胡曼筠等[6]已通过测定人工低温处理的离体叶片生理生化指标的方法对国内外20 余种常绿冬青的抗寒性进行了初步研究。但通过该方法只能得出供试冬青的相对抗寒性强弱顺序，无法确定其田间实际抗寒表现。而且植物抗寒性由多个因素共同控制，生理生化指标也易受环境和样本影响而发生变化[7-8]。所以，要想更准确地评价常绿冬青的抗寒性，还需要结合其它指标进行更全面的评价，并与田间实际抗寒表现进行对比验证。

植物叶片对低温胁迫极其敏感，可以通过改变组织结构来适应低温环境。而且叶片组织结构是生态环境和遗传基因共同影响的结果，具有一定生态适应性和稳定性，因此可将其作为植物抗寒性评价的重要指标[9]。前人已经就叶片组织结构与抗寒性的关系开展了大量研究，发现栅海比、叶片组织紧密度等叶片组织结构指标与植物抗寒性有极大相关性，但抗寒性评价的代表性指标因植物种类不同而有较大差异[10-13]。到目前为止，尚未见常绿冬青叶片组织结构与抗寒性关系的报道。

本研究以6 种常绿冬青为试材，调查其在山东泰安的田间冻害表现，并采用石蜡切片技术观测11 项叶片组织结构指标。以筛选出的叶片解剖结构代表性指标作为抗寒性评价指标，应用隶属函数法和聚类分析法对6 种冬青的抗寒性进行评价和分类，并将抗寒性顺序和分类结果与田间冻害调查结果进行对比。本研究从解剖结构特点和田间冻害表现两个层面对6 种常绿冬青开展抗寒性评价，可为常绿冬青属植物抗寒性综合评价及向北方高寒地区引种应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为2019年4月初从南京引进的6 种常绿冬青：‘阳光’ 狭冠冬青 （Ilex × attenuata ‘Sunny Foster’）、‘米叶’冬青（Ilex crenata ‘Mariesii’）、‘史蒂芬’冬青（Ilex× ‘Nellie R.stevens’）、‘中国少女’冬青（Ilex sp.‘China Girl’）、‘博福德’冬青（Ilex corunta ‘burfordir’）、‘蓝少女’冬青（Ilex merserae ‘Blue Girl’）。上述材料均为3年生扦插苗，每种60 株，定植于山东省泰安市岱岳区范镇苗木基地。

1.2 试验方法

1.2.1 田间冻害调查

2020年12月—2021年4月，泰安地区最低气温为-18℃。2021年3月中旬，调查6 种冬青自然越冬后的叶片形态变化情况，并采用下列标准进行冻害分级：1 级（抗寒性强）为冬季基本不受冻，仅叶片颜色稍变深，或少于20%的叶片受冻褐化，冬季观赏价值与其他季节差异不大；2 级（抗寒性中等）为20%-50%叶片受冻褐化，冬季观赏价值与其他季节相比明显降低；3 级（抗寒性差）为50%以上叶片受冻褐化，冬季基本失去观赏价值。每种冬青随机选择10 株长势一致的植株，每株调查100 个叶片，计算受冻叶片百分数，并拍照记录越冬后受害情况。

1.2.3 叶片组织结构观测

2020年12月中旬，摘取6 种冬青无病害、长势良好且相对一致的一年生枝条上倒数第2—4 个叶片，每种6 片，FAA 固定液中固定48 h 后贮藏于70%酒精中备用。常规石蜡切片法制片，切片厚度5—8 μm，番红-固绿染色，用Olympus BX51 显微镜检片，并拍照。每种冬青观察10 张切片，每张切片观察3 个叶片横切面视野和3 个主脉横切面视野。用Digimizer 4.5.1 软件测量叶片及其上下表皮、栅栏组织和海绵组织厚度，以及主脉木质部和维管束面积。

1.3 数据处理与分析

使用Microsoft Excel 2010 软件和SPSS 22.0 软件进行数据处理、相关性分析、差异显著性检验和聚类分析；运用隶属函数法计算6 种冬青抗寒性隶属函数值。

2 结果与分析

2.1 田间冻害表现

由表1 和图1 可知，自然越冬后6 种冬青均有不同程度的冻害表现。其中，‘史蒂芬’冬青和‘中国少女’冬青没有明显冻害，只有4.9%和5.3%的叶片局部失绿变为褐色，绝大多数叶片完好无损，冬季观赏价值与其他季节差异不大，冻害级别为1 级，抗寒性强；‘博福德’冬青和‘阳光’ 狭冠冬青有明显冻害，30.4%和36.8%的叶片全部或局部失绿变为褐色，冬季观赏价值与其他季节相比显著降低，冻害级别为2 级，抗寒性中等；‘蓝少女’冬青冻害严重，72.5%的叶片全部失绿变为褐色，‘米叶’冬青冻害更严重，86.3%的叶片全部失绿变为黄色并干枯，冬季基本失去观赏价值，冻害级别为3 级，抗寒性差。

图1 6 种冬青的田间冻害表现Figure 1 Freezing damage responsein the field of six Ilex varieties

表1 越冬后6 种冬青的冻害级别Table 1 Freezing damage grades of six Ilex varieties after winter

2.2 叶片组织结构比较

2.2.1 叶片厚度

由表2 和图2 可知，6 种冬青的叶片厚度为111.44～332.56 μm，差异较大。其中‘史蒂芬’冬青最厚，‘米叶’冬青最薄，两者相差1.99 倍。

2.2.2 表皮特征

由图2 可以看出，6 种冬青叶片表皮均由单层细胞构成，外覆角质层，上下表皮细胞均为不规则的扁长方形，排列紧密。由表3 可知，6种冬青的上表皮厚度和下表皮厚度差异均极显著。其中，上表皮厚度为13.34～32.90 μm，‘阳光’狭冠冬青最厚，‘米叶’冬青最薄；下表皮厚度为7.55～22.67 μm，‘史蒂芬’ 冬青最厚，‘米叶’冬青最薄。

2.2.3 叶肉组织结构特征

由图2 可知，6 种冬青叶片的栅栏组织细胞为3～5 层。其中，第1～3 层细胞排列紧密，第4～5 层细胞排列相对疏松，与海绵组织区分不明显。由表2 可知，6 种冬青的6 种叶肉组织结构指标均存在极显著差异： 栅栏组织厚度为22.45 ～86.72 μm，‘史蒂芬’ 冬青最大，‘米叶’冬青最小；海绵组织厚度为70.98 ～210.97 μm，‘中国少女’冬青最大，‘米叶’冬青最小；栅海比为0.22 ～0.42，‘史蒂芬’冬青最大，‘阳光’狭冠冬青最小；组织结构紧密度为0.15 ～0.26，‘史蒂芬’冬青最大，‘阳光’狭冠冬青最小；组织结构疏松度为0.52 ～0.84，‘米叶’冬青最大，‘史蒂芬’冬青最小。

图2 种冬青的叶片横切面Figure 2 Leaf transverse sections of six Ilex varieties

2.2.4 主脉维管束结构特征

由图3 可知，6 种冬青的主脉均属外韧维管束，韧皮部均有大量晶细胞。由表2 可知，6 种冬青的叶片主脉木质部面积和主脉维管束面积均存在极显著差异： 主脉木质部面积和主脉维管束面积分别为3368.69 ～20732.52 μm2和5663.57～45493.51 μm2，‘史蒂芬’冬青最大，‘蓝少女’冬青最小；木维比为0.41 ～0.61，‘米叶’冬青最大，‘中国少女’冬青最小。

图3 6 种冬青的叶片主脉横切面Figure 3 Leaf midrib transverse sections of six Ilex varieties

表2 6 种冬青叶片解剖结构指标Table 2 Anatomical structure indexes of six Ilex varieties

2.4 6 种冬青的抗寒性综合评价

由图4 可知，11 项叶片解剖结构指标可分为3 类：叶片厚度、海绵组织厚度、栅栏组织厚度、主脉木质部面积、主脉维管束面积、下表皮厚度和上表皮厚度为第1 类；栅海比和组织结构紧密度为第2 类；组织结构疏松度和木维比为第3 类。

图4 11 项叶片结构指标的变量聚类分析Figure 4 Variable cluster analysis of 11 leaf structure indexes

由表2、表3 和表4 可知：第1 类中，叶片厚度的相关指数最大，可作为该类的代表性指标；第2 类中，栅海比和组织结构紧密度的相关指数相等，但前者变异系数较大（34.84%），故选择栅海比作为该类的代表性指标；第3 类中，组织结构疏松度和木维比的相关指数相等，但前者变异系数较大（18.34%），故选择组织结构疏松度作为该类的代表性指标。

表3 叶片结构指标的相关系数Table 3 Correlation coefficient of leaf structure indexes

表4 各类中指标相关指数及排序Table 4 Correlative indexes and order of parameters

将筛选出的3 项叶片抗寒性解剖结构指标（叶片厚度、栅海比、组织结构疏松度）作为抗寒性评价指标，应用隶属函数法对6 种冬青的抗寒性进行评价。根据平均隶属度大小（表5），6 种冬青的抗寒性强弱依次为：‘史蒂芬’ 冬青＞‘中国少女’ 冬青＞‘博福德’ 冬青＞‘阳光’ 狭冠冬青＞‘蓝少女’冬青＞‘米叶’冬青。

表5 6 种冬青的抗寒性综合评价Table 5 Comprehensive evaluation on cold resistance of six Ilex varieties

对6 种冬青的抗寒平均隶属函数值进行聚类分析（图5），可将6 种冬青分为3类：‘史蒂芬’冬青和‘中国少女’冬青为第1 类，抗寒性强；‘博福德’冬青和‘阳光’狭冠冬青为第2 类，抗寒性中等；‘蓝少女’冬青和‘米叶’冬青为第3 类，抗寒性弱。这与田间冻害调查分类结果一致。

图5 6 种冬青的抗寒性聚类分析Figure 5 Cluster analysis on cold resistance of six Ilex varieties

3 讨论

抗寒性是植物长期适应寒冷环境而形成的一种遗传特性，取决于植物的外部形态特征、解剖结构特性、生理生化特点和外界环境条件等。叶片组织结构是生态环境和遗传基因共同影响的结果，具有一定生态适应性和稳定性，因此越来越多的研究者将其作为植物抗寒性评价的重要指标。但植物种类不同，抗寒性评价代表性指标有较大差异。因此，先采用科学的数据统计分析方法从多项叶片结构指标中筛选出代表性评价指标，是科学评价植物抗寒性的重要前提[10-12]。

本研究采用变异系数、相关分析和聚类分析从11 项叶片结构指标中筛选出了叶片厚度、栅海比和组织结构疏松度作为评价6 种冬青抗寒性的代表性指标，结果发现：栅海比越大，组织结构疏松度越小，冬青抗寒性越强，这与翅荚木[14]、柿[15]、樟树[16]、含笑[10]、重楼[12]等植物的研究结果一致；叶片厚度越大，冬青抗寒性越强，这与核桃[17]、早实核桃[18]、桃[11]等植物的研究结果一致。但有的研究者认为，与栅海比和组织结构疏松度等复合结构指标相比，叶片总厚度和栅栏组织厚度等单一结构指标易受样本或环境影响而改变，并不能准确体现样本间的抗寒遗传差异[19]。所以，叶片厚度能否作为代表性指标用于其他常绿冬青的抗寒性评价还需扩大样本进一步研究。

另外，谭殷殷等[20]和高驰等[12]发现，测定叶片组织结构指标时的取材时期不同，筛选出的抗寒性评价代表性指标也不同，导致同一植物在不同时期的抗寒性排序结果差异较大。目前尚未有常绿冬青叶片组织结构与抗寒性关系的其它报道。本研究筛选指标时虽已进入越冬期，但仅限于12月份，且仅涉及到6 种常绿冬青。所以，要想筛选出更具代表性的常绿冬青抗寒性评价代表性指标，还应增加1月份和2月份的越冬期数据，并进一步加大样本数量。

植物抗寒性强弱并不单取决于某一类或某一个指标，而是叶片组织结构中多类指标、多个指标交互作用的结果。所以，本研究将筛选出的叶片厚度、栅海比和组织结构疏松度3 个代表性叶片组织结构指标结合起来作为抗寒性评价指标，应用隶属函数法和聚类分析法对6 种冬青的抗寒性进行评价并分类，得出的抗寒性顺序结果和分类结果与田间冻害调查得出的结果一致。这说明，将叶片厚度、栅海比和组织结构疏松度作为代表性叶片组织结构指标来评价6 种冬青的抗寒性具有较高可靠性。