地夸磷索钠滴眼液在肉毒杆菌毒素B诱导的干眼模型中的应用研究

冀杰 吕佳 庞龙 林斌武

干眼(Dry eye)是一种由多种致病因素(眼表的病理改变，炎症反应，性激素水平改变等等)所导致的，可以威胁到视力的常见眼表疾病。其特征性的表现主要为眼部不适，视力下降，泪膜不稳定并伴随泪液渗透压的增加和眼表的炎症状态[1]。目前对于干眼的治疗手段包括用眼习惯的改善、物理疗法、药物疗法与必要时的手术干预。而药物疗法，是目前干眼的主要治疗方法。治疗干眼的滴眼液主要有人工泪液、皮质类固醇激素、非甾体类抗炎药以及免疫抑制剂等[2]。其中0.3%玻璃酸钠滴眼液是目前应用最广泛且最具代表性的干眼治疗药物，可以单独使用，也可以联合使用。而3%浓度的地夸磷索钠(diquafosol tetrasodium，DQS)是一种P2Y2受体激动剂，P2Y2受体激动剂是一种治疗干眼症的新型药物,它能够通过激动位于眼表的P2Y2受体[3-4]，促使结膜上皮细胞泪液的分泌以及结膜杯状细胞对黏蛋白的分泌，从而增强泪膜稳定性，改善干眼症状，同时也有研究表明，3%DQS滴眼液可以改善干眼大鼠眼表炎症因子水平[5]。因此，本研究通过对比0.3%玻璃酸钠滴眼液，3%地夸磷索钠滴眼液以及二者联合以后对于干眼小鼠治疗作用，从而进一步探索3%地夸磷索钠滴眼液在干眼中的应用。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级CBA/J小鼠40只，雌性，6～8周龄，体重13～18 g。全部购自北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养于SPF级标准动物房，自由取食饮水。本实验中所有小鼠喂养和研究过程均遵循《实验动物管理条例》，符合动物伦理学要求。

1.2BTX-B干眼动物模型的建立[6]参考文献中所报道的方法：(1)配制20mU/50uL的BTX-B溶液，造模前30分钟配制，4℃保存。(2)4.3%水合氯醛腹腔注射(10mL/kg)麻醉小鼠。(3)将小鼠置于显微操作台上，手术显微镜下检查所有鼠眼无炎症及其它病变，选取右眼为实验眼，0.5%丙美卡因滴眼液行表面麻醉。(4)在显微镜下，用棉签拭去结膜囊内多余的液体，用显微无齿镊轻轻将眼球向下拨开，透过球结膜观察泪腺位置。(5)将带有33G针头的注射器，吸取50ul BTX-B溶液。(6)透过球结膜将50ul BTX-B溶液注入小鼠泪腺中，妥布霉素眼膏涂眼。

1.3实验方法 将40只造模完成后小鼠随机分为4组，每组10只：生理盐水组：给予生理盐水治疗,1 滴/ 次,4 次/天，连续28天。玻璃酸钠滴眼液组：给予0.3%玻璃酸钠滴眼液[参天制药( 中国) 有限公司,国药准字J20070064,]治疗,1滴/次,4 次/天，连续28天。地夸磷索钠滴眼液组：给予3%地夸磷索钠滴眼液[参天制药( 中国) 有限公司,国药准字J20180008] 治疗,1 滴/ 次,4次/天，连续28天。联合组：同时给予玻璃酸钠滴眼液及地夸磷索钠滴眼液治疗，1 滴/ 次,4次/天，连续28天。

1.4检测指标

1.4.1泪液分泌量的检测及角膜上皮荧光素染色 分别在造模前1天，造模后第3天，滴用眼药水后第3，7，14和28天进行检测。用酚红棉线法测量小鼠泪液分泌量。具体如下：小鼠在未麻醉状态下，将小鼠固置于手术显微镜下，用镊子夹持一根酚红棉线，轻轻放置在小鼠的内眦部，注意不要刺激角膜，持续15s，游标卡尺测量泪液分泌长度。用荧光素钠法评估小鼠角膜上皮的缺损情况。具体如下：小鼠处于未麻醉状态，0.5%荧光素染色，裂隙灯钴蓝光下观察角膜上皮愈合情况，上皮缺损处显示绿色，裂隙灯拍照并评分。评分标准：将角膜分为5个区域，每个区域分别评分。0分，无染色；1分，散在点状染色；2分，弥漫点状染色；3分，片状染色。5个区域评分完毕后将其总和。

1.4.2角结膜组织中炎症因子的表达 在滴用滴眼液28天后，处死小鼠，收集角结膜组织检测IL-1 β和TNF-α的mRNA及蛋白表达水平。采用实时定量PCR反应检测角结膜中IL-1 β和TNF-α的mRNA表达水平，采用SYBR®Platinum®Green qPCR SuperMix-UDG with ROX(Invitrogen 公司)试剂盒在ABI PRISM 7000中完成反应。每个样品做3个复孔。(引物见表1)。 以GAPDH为内参相对定量各组样品目的基因的表达水平，用2-ΔΔCT法进行相对定量分析。用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国Invitrogen)检测小鼠角结膜组织中IL-1 β和TNF-α的蛋白水平。

表1 小鼠定量PCR反应引物

1.5统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数± 标准差( Mean±SD) 表示,根据数据的分布模式及方差齐性采取t检验或者秩和检验；计数资料以率(%) 表示,采用2检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1各组小鼠泪液分泌和角膜荧光素钠染色评分的改变情况 通过对造模前1天，造模后第3天，给药后第3，7，14和28天的泪液分泌量(酚红棉线法，图1和表2)和角膜荧光素钠染色评分(图2和表3)分析可得：相对于造模前(pre-injection)，造模后第3天(baseline)泪液分泌量明显降低(P<0.05)。给予不同滴眼液干预以后，对比生理盐水组(saline)，联合用药组(0.3%HA +3%DQS)于2周时(week 2)(P<0.05)，泪液分泌量开始明显增加(P<0.05)，并有统计学意义，用药4周后 (week 4)，玻璃酸钠组(0.3%HA)和地夸磷索钠组(3%DQS)才产生具有统计学差异的泪液分泌增加(P<0.05)，玻璃酸钠组和地夸磷索钠组之间未见明显统计学差异(P>0.05)，联合用药组的泪液分泌量明显多于玻璃酸钠组和地夸磷索钠组(P<0.05)。

图1 泪液分泌

表2 各组小鼠泪液分泌量的变化

图2 角膜荧光素染色

表3 各组小鼠角膜荧光素钠染色评分变化情况

相对于造模前(pre-injection)，造模后第3天(baseline)角膜荧光素钠染色评分明显升高(P<0.05)。给予不同滴眼液干预以后，对比生理盐水组(saline)，联合用药组(0.3%HA+3%DQS)、玻璃酸钠组(0.3%HA)和地夸磷索钠组(3%DQS)于4周时(P<0.05)，角膜荧光素钠染色评分明显改善(P<0.05)，并有统计学意义，玻璃酸钠组和地夸磷索钠组之间未见明显统计学差异(P>0.05)，联合用药组的角膜荧光素钠染色评分明显低于玻璃酸钠组和地夸磷索钠组(P<0.05)。

2.2各组小鼠角结膜组织中炎症因子表达情况 在滴用滴眼液4周后，处死小鼠，收集角结膜组织检测IL-1 β和TNF-α的mRNA及蛋白表达水平(图3和表4)。结果显示：相对于生理盐水组(saline)，联合用药组(0.3%HA+3%DQS)、玻璃酸钠组(0.3%HA)和地夸磷索钠组(3%DQS)小鼠角结膜组织和泪腺组织炎症因子TNF-α和IL-1β的表达的mRNA和蛋白表达水平明显降低(P均<0.05)，且玻璃酸钠组和地夸磷索钠组之间未见明显统计学差异(P>0.05)，联合用药组的角膜荧光素钠染色评分明显低于玻璃酸钠组和地夸磷索钠组(P<0.05)。

图3 眼表炎症因子

表4 各组小鼠角结膜炎症指标表达情况

3 讨论

干眼症流行病学研究显示： 30～40岁干眼症发病率超过20%,70岁以上发病率则达到36.1%，其中女性的发病率较高，约为22.18%；男性的发病率较低，约为14.9%[7]，并且近年来干眼症的发病率有逐年增高的趋势，故对干眼症发病机制以及治疗方法的研究具有十分重要的意义。同时越来越多的证据显示，炎症在干眼的发病以及疾病进展过程中发挥重要作用。尽管引起干眼的起始病因以及参与的因素不同(如炎症，细胞凋亡、神经调节及性激素等)，但一旦进入进展阶段，炎症将成为干眼症发病机制中最关键的因素,从而使不同类型的干眼症表现出相似的病理生理改变，目前对于炎症在干眼发病机制中的作用的研究，其主要观点为：各种病理因素的损伤导致干眼后直接或间接的引起眼表炎症，眼表炎症再进一步导致眼表上皮或泪腺功能的障碍，从而加重干眼的症状[8-9]。因此，我们在研究中初步探讨了玻璃酸钠滴眼液、地夸磷索钠滴眼液以及二者联合使用，对干眼小鼠的临床指标(泪液分泌以及角膜荧光素钠染色评分)以及眼表炎症水平的改善情况。

迄今为止，干眼相关的动物模型种类很多，按动物种类来分，有兔，鼠和狗。以造模方式来分则有，手术摘除泪腺和副泪腺，肌肉注射阿托品，破坏眼表的神经支配，环境诱导干眼模型(暴露于高流量的空气中)，皮下注射东莨菪碱，环境与皮下注射东莨菪碱相结合等等。在这些诱导方法中，皮下注射东莨菪碱或环境与皮下注射东莨菪碱相结合的干眼模型，是目前较为经典也较为常用的干眼模型，然而该两种方法所诱导的干眼状态，通常持续的时间较短，干眼的状态也不是很稳定[10]。而本研究所采用的干眼动物模型为：小鼠泪腺内注射肉毒杆菌毒素B(BTX-B)诱导的干眼模型，此模型是2006年Olan Suwan-apichon最早报道的一种模拟非干燥综合征性干眼的干眼模型[6]，相比于其他的经典干眼模型，此模型持续时间更久，持续时间可达30～60天，也更加稳定，更加符合干眼这一慢性疾病的病理过程。因此我们选择该种动物模型作为此次研究的干眼模型。

地夸磷索钠滴眼液是一种P2Y2受体激动剂，于2010年在日本上市。P2Y2受体在全身表达，并存在于角膜及结膜上皮细胞、结膜杯状细胞以及睑板腺中[11]。当地夸磷索钠与位于结膜杯状细胞膜上的P2Y2受体结合后，可以刺激杯状细胞分泌黏蛋白， 同时开结膜上皮细胞膜上的Ca2+依赖性Cl-通道，产生渗透压差，促进结膜上皮液体的分泌，从而增加泪液的分泌[12-13]，由此可见，地夸磷索钠可同时增加泪膜中水分和黏蛋白的含量，在质和量两方面改善泪液的分泌，从而增强泪膜稳定性[14-15]。在实验中，单独使用地夸磷索钠或玻璃滴眼液都可以增加干眼小鼠的泪液分泌，降低眼表荧光素染色评分以及改善眼表炎症因子的表达情况，但和玻璃酸钠滴眼液相比，地夸磷索钠滴眼液未表现出明显的优越性。经联合使用后，对干眼小鼠的治疗效果以及对眼表炎症情况的改善明显好于单独使用，这可能和二者的互补性有关。根据最近日本干眼协会提出的一种全新的干眼治疗方法，泪膜定向疗法[16]，该方法基于干眼的泪膜的逐层诊断，通过各种诊断技术，将干眼的病因精确的定位于泪膜的不同层次，然后针对不同泪膜的层次从而有针对性的治疗，其中，玻璃酸钠滴眼液就是主要用于改善水液层，地夸磷索钠滴眼液则可以同时改善脂质层，水液层和黏蛋白层，但由于结膜上皮自分泌增加的泪液量较主泪腺和副泪腺所分泌的泪液量明显偏少，所以地夸磷索钠滴眼液对水液层的治疗作用有限，而玻璃酸钠滴眼液正好弥补了地夸磷索钠滴眼液之一不足之处，因此，二者联合以后对干眼的治疗作用明显好于单独使用。另外，如前所述，炎症在干眼中的作用越来越被重视，地夸磷索钠滴眼液联合玻璃酸钠滴眼液滴眼液可以有效的抑制眼表炎症因子的分泌，可增强其对干眼的治疗作用。

综上所述，单独地夸磷索钠滴眼液和玻璃酸钠滴眼液均能对肉毒杆菌毒素B诱导的干眼小鼠起一定的治疗作用，并且二者联合使用以后，会产生一定的互补作用，使治疗作用大大加强，并能明显改善眼表的炎症状态，从而更加有效的治疗干眼。