支气管哮喘患儿血清miR-34、Notch1水平与气道炎症的相关性分析

朱萍 别国梁 司海超

支气管哮喘(bronchial asthma, BA)是学龄期儿童常见的呼吸系统疾病，以气急、喘息、咳嗽、胸闷等反复发作为临床表现，可严重影响患儿生活及学习质量[1]。目前，BA发病相关因素尚未解释完全，但研究认为其与炎性介质、微小RNA(microRNA, miRNA)、炎症细胞、免疫应答等有关[2]。研究发现，微小RNA-34(microRNA-34, miR-34)miR-34在BA患者中呈低表达，其可能是治疗BA的潜在靶标[3]；另外，miR-34与Notch1存在负调控关系，且Notch1在过敏性哮喘中表达上调，其可能参与过敏性哮喘病理发展过程[4-5]。miR-34在BA中虽已有研究，但其在BA患儿中与Notch1的相关性及两者与气道炎症的关系鲜有报道。基于此，本研究通过检测BA患儿血清miR-34、Notch1表达水平，分析两者与白介素-17(interleukin-17, IL-17)、嗜酸性粒细胞(Eosinophils, EOS)、白介素-10(interleukin-10, IL-10)等气道炎症指标的关系，以期为临床诊断BA提供依据。

资料与方法

一、 临床资料

选取2018年10月～2020年5月本院诊治的BA患儿94例进行研究(BA组)，其中男52例，女42例；年龄2～12岁，平均年龄(7.28±3.85)岁。并选取同期体检健康儿童90例进行对照研究(健康组)，其中男54例，女36例；年龄1～13岁，平均年龄(7.63±3.97)岁。健康组与BA组性别比例、年龄差异无统计学意义(χ2=0.413,t=0.607，P均>0.05)。另外，收集两组家族哮喘史、个人过敏史、家族过敏等资料。BA诊断标准：依据《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》有关BA判定标准进行诊断[6]。纳入标准：(1)患者均符合BA诊断标准；(2)患者均具备完整的生理病理检查资料。排除标准：(1)合并糖尿病、系统红斑狼疮或其它自身免疫性疾病者；(2)合并过敏性疾病史、严重肝肾疾病者；(3)合并肿瘤者；(4)合并鼻炎、慢阻肺、其他病原体导致的肺部炎症病变；(5)合并高血压或其他心血管疾病者。

受试儿童直系亲属签署知情同意书，所用方法符合《赫尔辛基宣言》，获得本院伦理委员会审核批准。

二、方法

1 样本收集 收集所有患儿入院后，治疗前、健康儿童体检当日清晨空腹外周血约5 mL，分成两份。一份于室温下，静置约30 min，4℃以5200 r/min离心6 min，分离上层血清，置于无菌EP管中，于-80℃冰箱中保存；另一份置于EDTA-K2抗凝管中，混匀，3h内上机检测EOS水平。

2 qRT-PCR法检测血清miR-34、Notch1 mRNA表达水平 解冻适量冻存血清样本，采用Trizol法按Trizol试剂盒(货号：RP2401，无锡百泰克生物技术有限公司)说明书抽提样本总RNA。使用紫外分光光度计(型号：DU-730，上海普迪生物技术有限公司)检测RNA质量。严格参照PrimeScript TM RT Master Mix(货号：RR036A，北京冬歌博业生物科技有限公司)说明书将2.0 μL总RNA逆转录为cDNA。利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)仪(型号：MA-4800，苏州雅睿生物技术有限公司)和SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒(货号：HY-K0521，MedChemExpress LLC)完成PCR扩增检测，其中扩增反应体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10.0 μL，上/下游引物各1 μL，cDNA 2.0 μL，加ddH2O至总体积为25.0 μL，各引物序列详(见表1)；另外，程序设定为：97℃预变性6 min；95℃变性15 s，62℃退火20 s，45个循环。反应完成后收集各样本数据，以2-ΔΔCT法计算miR-34、Notch1 mRNA相对表达量(见表1)。

表1 miR-34、Notch1及内参U6、GAPDH的引物序列

3 ELISA法检测血清IL-17、IL-10水平 从冰箱中取出IL-17、IL-10 ELISA试剂盒内的标准品，严格按其说明书将标准品配制成一系列浓度标准品溶液，应用酶标仪(型号：PT-3502G，北京普天新桥技术有限公司)检测不同浓度标准品溶液的吸光度，制作IL-17、IL-10的标准回归曲线；室温下解冻适量血清样本，平衡10 min，于酶标板中加血清样本，37℃培养箱中孵育约30 min，添加生物素工作液(含IL-17/IL-10抗体)，37℃培养箱中孵育约50 min，弃掉反应液，磷酸缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)冲洗2次；加显色液，37℃培养箱中孵育约30 min，加终止反应液，于450nm处测定各样本的吸光度，计算血清IL-17、IL-10水平。

4 EOS水平检测 取适量外周血，利用血细胞分析仪(型号：普康 PE-6100，潍坊嘉松医疗器械有限公司)按说明书进行常规操作，检测EOS水平。

三、统计学方法

结 果

一、两组一般资料比较

与健康组相比，BA组患儿家族哮喘史、个人过敏史、家族过敏史均明显升高(P<0.05)，年龄、男/女构成比例无明显差异(见表2)。

表2 两组一般资料比较

二、两组血清miR-34、Notch1 mRNA、IL-17、IL-10及外周血EOS水平比较

与健康组相比，BA组患儿血清miR-34及IL-10水平均降低(P<0.05)，Notch1 mRNA、IL-17、EOS水平均明显升高(P<0.05)(见表3)。

表3 两组血清miR-34、Notch1 mRNA、IL-17、IL-10及外周血EOS水平比较

三、BA患儿血清miR-34、Notch1 mRNA表达水平与IL-17、IL-10、EOS的相关性

Pearson法分析显示，BA患儿血清miR-34表达水平与IL-17、EOS呈负相关(P<0.05)，与IL-10呈正相关(P<0.05)；血清Notch1 mRNA表达水平与IL-17、EOS呈正相关(P<0.05)，与IL-10呈负相关(P<0.05)(见表4)。

表4 BA患儿血清miR-34、Notch1 mRNA表达水平与IL-17、IL-10、EOS的相关性

四、BA患儿血清miR-34表达水平与Notch1 mRNA相关性

Pearson法分析显示，BA患儿血清miR-34表达水平与Notch1 mRNA呈负相关(r=-0.467，P<0.05)(见图1)。

图1 BA患儿血清miR-34表达水平与Notch1 mRNA相关性

五、 影响BA发生的Logistic回归分析

以miR-34(>0.73=0，0.53～0.73=1,0.23～0.52=2，<0.23=3)、Notch1(<1.28=0，1.28～1.89=1,1.90～2.50=2，>2.5=3)、IL-17(<12.44 ng/L=0，12.44 ng/L～18.54 ng/L=1,18.54 ng/L～24.64 ng/L=2，>24.64 ng/L=3)、IL-10(>12.11 ng/L=0，9.03 ng/L～12.11 ng/L=1,5.95 ng/L～9.02 ng/L=2，<5.95 ng/L=3)、EOS(<0.76 ×109/L=0，0.76 ×109/L～1.17 ×109/L=1,1.18 ×109/L～1.58 ×109/L=2，>1.58 ×109/L=3)、家族哮喘史(无=0，有=1)、个人过敏史(无=0，有=1)、家族过敏史(无=0，有=1)为自变量，以是否发BA为因变量(发生=1，未发生=0)，Logistic回归分析显示，miR-34是影响BA发生的独立保护因素(P<0.05)，Notch1、IL-17、家族哮喘史、个人过敏史、家族过敏史是影响BA发生的独立危险因素(P<0.05)(见表5)。

表5 Logistic回归分析发生BA的影响因素

讨 论

BA在儿童中多有发生，其以气道重塑、气道反应性增高及慢性气道炎症为主要特征，可引发肺脏乃至全身反应，对患儿健康成长构成极大威胁[7-8]。因此，寻找与气道炎症有关、且可早期诊断、评估BA患儿疾病进展的指标，及时防控BA，对改善患儿生存状态有积极意义。

miRNA可参与并调控免疫炎症反应、自噬、信号转导、机体发育、细胞增殖、凋亡、血管新生等生物过程，与呼吸窘迫综合征、肺动脉高压、肺癌、BA等相关[9-10]。研究发现，miR-34作为miRNA家族成员，其在非小细胞肺癌患者血浆中表达异常，miR-34a/c有望成为评估非小细胞肺癌患者预后的标志物[11]；另外，Yin等[3]发现BA患者miR-34表达下调，其可能通过影响自噬、气道重塑过程，从而在BA病变进展中起重要作用。以上研究表明，miR-34异常表达可能与BA类肺部疾病有关。本研究中BA组患儿血清miR-34表达下调，提示miR-34可能在BA发生发展中具有重要调控作用，究其原因，低水平miR-34可能通过调节机体信号转导、自噬、炎症反应等过程，造成其抑制气道重塑能力减弱，从而影响BA发生发展，但其具体机制有待深入探讨。

Notch信号通路在多种组织/器官发育及疾病发生发展中有重要作用，而Notch1是其家族重要成员。研究发现，Notch1在哮喘中呈异常表达，经大豆肽作用后，其表达水平降低，Notch1信号通路可能受大豆肽调节，进而抑制哮喘气道炎症反应[12]；此外，盛安群等[5]研究显示过敏性哮喘中Notch1，与IL-17显著相关，Notch1可能与炎症因子相互影响进而在过敏性哮喘中发挥重要作用。以上研究证实，Notch1可能在气道炎症类疾病中起重要作用。本研究中BA组患儿血清Notch1 mRNA表达上调，推测，高水平Notch1可能影响相关信号通路表达，加重气道炎症反应，从而促进BA发生发展，具体机制需进一步探究证实。

Th17细胞可诱导机体发生炎症反应，而其分泌的IL-17是影响气道炎症反应的重要因子，IL-17可通过活化IL-8、IL-6等细胞因子，募集、活化中性粒细胞，促进多种炎症因子分泌，导致机体发生炎症反应[13]；IL-17在BA患者血清中水平明显增加，其可辅助判定BA患者气道炎症程度[14]。IL-10主要是由Treg细胞分泌的抑炎因子，其可活化其它抑炎因子，清除/抑制炎症部位的EOS，从而减轻炎症反应[14]；IL-10在BA患儿中表达下调，与BA病情进展有关[15]。此外，气道局部募集EOS及其介导的炎症反应是BA发病的重要机制，EOS在BA患者中水平升高，与肺功能、疾病进展程度密切相关[16]。本研究中BA组患儿IL-17、EOS水平升高，IL-10水平降低，与前人研究一致[14-16]，提示IL-17、IL-10、EOS可能通过影响气道炎症反应，进而影响BA病变过程，但仍需深入探究具体机制。

本研究中BA患儿血清miR-34、Notch1 mRNA表达水平与IL-17、IL-10、EOS，及miR-34表达水平与Notch1 mRNA均显著相关，提示miR-34、Notch1可能与IL-17、IL-10、EOS，及miR-34与Notch1影响，进而协同影响BA病理发展，其机制有待深入研究。进一步研究显示，miR-34是影响BA发生的独立保护因素，Notch1、IL-17、家族哮喘史、个人过敏史、家族过敏史是影响BA发生的独立危险因素，提示血清miR-34水平降低、Notch1、IL-17水平升高，伴有家族哮喘史、个人过敏史、家族过敏史均可能增加儿童发生BA风险，及时确定上述指标有利于临床早期诊断BA。

综上所述，BA患儿血清miR-34表达下调，Notch1表达上调，两者呈负相关，且均与气道炎症密切相关，及时诊断血清miR-34、Notch1水平，有助于临床筛查BA患儿。但本研究未深入miR-34、Notch1 mRNA在BA中的具体机制，且样本量较少，后期将进行探究。