外周血ctDNA及Survivin预测NSCLC预后的临床研究

齐艳梅 李瑞杰 汪领

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是指源于支气管黏膜上皮或肺泡上皮的恶肿瘤，属于常见的肺癌类型，约占肺癌的80%，根据病理类型可分为鳞癌、腺癌、大细胞癌等，临床典型症状表现为咳嗽、咯血、呼吸困难、胸痛等，晚期患者会出现转移部位相应症状，脓胸、病理性骨折等是其常见并发症，发病率及病死率较高，多数患者确诊时已是晚期，预后较差[1-2]。因此，寻找NSCLC预后的相关分子预测指标，为患者制定个体化治疗方案具有重要意义。随着分子生物学技术水平的不断提高，肺癌分子生物学预后预测指标成为近年来肺癌研究领域的热点。研究发现，肿瘤患者外周血中的循环肿瘤DNA(circulating tumor，ctDNA)可用于动态监测肿瘤变化、判断患者预后等[3]。凋亡抑制蛋白存活素(Survivin)是凋亡抑制蛋白家族的新成员，在多种肿瘤中高表达，与肺癌的发生、诊断和预后密切相关[4]。本研究通过综合分析NSCLC患者外周血ctDNA及Survivin表达水平，评估其对患者预后的预测作用。

资料与方法

一、临床资料

本次研究选取2017年2月—2018年2月收治的138例经病理学检查确诊的NSCLC患者作为研究组。纳入标准：①经纤维支气管镜或经皮肺穿刺活检病理确诊为原发性NSCLC者；②首次诊断为鳞癌或腺癌且未发生远处转移者；③术前未接受任何新辅助放化者；④无手术禁忌证者。排除标准：①患有其它恶性肿瘤、血液系统、神经系统疾病者；②合并严重心、肝、肾等器官功能障碍者；③术前发生血栓栓塞性疾病者；④有手术禁忌证者；⑤术前应用抗凝药物治疗者。研究组：男104例，女34例；吸烟96例，不吸烟42例；年龄37～72岁，平均(54.56±10.84)岁；鳞癌67例；腺癌71例；高分化61例，低分化77例；p-TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期42例，Ⅲ～Ⅳ期96例；淋巴结转移41例，淋巴结无转移97例；肿瘤直径2～7 cm，平均(4.51±2.16)cm。同期，于医院体检中心招募56例年龄、性别、吸烟史与NSCLC患者完全匹配的健康志愿者作为对照组，男39例，女17例；吸烟31例，不吸烟25例；年龄35～64岁，平均(53.37±10.26)岁。两组性别、是否吸烟、年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)(见表1)。本研究随访第一终点为末次随访或死亡时间，随访方式包括门诊复查、电话和信件随访，随访终止日期为2021年2月。

二、检测方法

①标本采集与处理：分别收集所有受试者外周血5 mL，经乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝处理，1500 r/min离心10 min(离心半径15 cm)，收集血浆保存于-80℃冰箱待用。②ctDNA含量测定：使用血浆游离DNA分离试剂盒依次进行ctDNA大片段分离、小片段回收、DNA末端修复和A接头连接；提取NSCLC患者血浆ctDNA作为模板进行PCR扩增，反应条件为94℃预变性5 min，95℃退火15 s、60℃延伸30 s，共40个循环，HepG2细胞中提取DNA，倍比稀释后扩增，上述测量均重复3次，并进行探针杂交捕获和序列的测序分析。③Survivin mRNA含量测定：根据试剂盒操作说明，应用Trizol提取RNA，使用紫外分光光度计定量并检测其纯度，经琼脂糖电泳鉴定其完整性，-80℃保存待用；使用1 μg总RNA、2 μL×10缓冲液、2 μL dNTPs(10 mmol/L)、100 ng随机引物、2 μL M-MLV(10 U/μL)加DEPC水组成20 μL反应体系进行cDNA合成；采用1×定量缓冲液、200 μmol/L dNTPs、5 U ampliTaq Gold、各600 nmol/L的Survivin上、下游引物、200 nmol/L荧光探针、100 ng cDNA组成的50 μL反应体系进行实时荧光定量PCR(qPCR)扩增，以GAPDH为内参照，反应条件为：95℃预变性3 min，95℃变性10 s，然后57℃退火30 s，72℃延伸60 s，共40个循环，反应结束后，根据标准曲线仪自动进行分析。本研究所用试剂盒购于厦门艾德生物医药有限公司，并严格按照操作步骤进行操作，逆转录反应试剂均购于上海玉博生物科技有限公司，引物序列由天根生化科技(北京)有限公司合成。

三、统计学处理

表1 两组基线资料比较

结 果

一、NSCLC患者与健康志愿者外周血ctDNA和Survivin mRNA表达水平比较

研究组外周血ctDNA和Survivin mRNA表达水平均高于对照组(P<0.05)(见表2)。

表2 两组外周血ctDNA和Survivin mRNA表达水平比较

二、NSCLC患者外周血ctDNA及Survivin mRNA表达水平的界限值

根据ROC曲线，患者外周血ctDNA和Survivin mRNA的最佳截点分别为17.23 ng/mL和5.34×105copies/mL(见图1)。

图1 确定NSCLC患者外周血ctDNA及Survivin mRNA表达水平界限值的ROC曲线

三、影响NSCLC患者预后的单因素分析

单因素分析显示，性别、年龄、组织学分型、肿瘤分化程度、淋巴结有无转移、肿瘤直径、是否吸烟、术后是否放疗及是否使用分子靶向药物患者的平均生存时间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；术后化疗、p-TNM分期Ⅰ～Ⅱ、ctDNA表达水平<17.23 ng/mL、Survivin mRNA表达水平<5.34×105copies/mL患者平均生存时间均高于术后未化疗、p-TNM分期Ⅲ～Ⅳ、ctDNA表达水平≥17.23 ng/mL、Survivin mRNA表达水平≥5.34×105copies/mL患者(P<0.05)(见表3)。

表3 影响NSCLC患者预后的单因素分析

四、 Kaplan-Meier生存曲线分析NSCLC患者外周血ctDNA、Survivin mRNA表达水平与预后的相关性

外周血ctDNA表达水平≥17.23 ng/mL、Survivin mRNA表达水平≥5.34×105copies/mL患者与外周血ctDNA表达水平<17.23 ng/mL、Survivin mRNA表达水平<5.34×105copies/mL患者生存曲线比较，差异均有统计学意义(P<0.05)(见图2)。

图2 外周血ctDNA及Survivin mRNA表达水平与NSCLC患者预后关系

五、影响NSCLC患者预后的COX多因素分析

将单因素分析中有统计学意义的p-TNM分期、术后是否化疗、ctDNA表达水平、Survivin mRNA表达水平因素纳入COX比例风险模型进行多因素分析，结果显示p-TNM分期、ctDNA表达水平、Survivin mRNA表达水平均是影响NSCLC患者预后的独立危险因子(P<0.05)(见表4)。

表4 影响NSCLC患者预后的COX多因素分析

讨 论

NSCLC是病死率较高的恶性肿瘤之一，以65岁以上人群居多，但近年来发病有年轻化趋向，其确切病因尚未完全明确，可能与环境因素、自身因素和遗传因素有关[5]。临床上常通过手术切除、放射治疗、化学治疗、靶向治疗、免疫治疗等一系列手段进行综合治疗，但5年生存率无明显提高，多数患者仍死于肺癌的局部复发或远处转移[6]。因此，精准评估肺癌患者的预后，从而积极采取个体化的肺癌治疗这一问题亟待解决。随着分子病理学研究的进展，越来越多的研究发现检测相应分子标志物的突变基因进而选择最佳靶向药物对肺癌的治疗具有非常重要的指导作用[7]。

外周血是最常使用的液体活检标本之一。本研究结果显示，NSCLC患者外周血ctDNA与Survivin mRNA表达水平明显高于正常对照组，提示NSCLC患者外周血ctDNA与Survivin mRNA表达异常。ctDNA是肿瘤细胞DNA经脱落或细胞凋亡时释放入外周血的小片段DNA，大小通常为160～180 bp，包含了肿瘤组织的全部遗传信息，与原发肿瘤DNA具有相同的特征，可反应肿瘤组织中基因的突变状态，实现实时监测，从而指导患者的靶向治疗，改善患者预后[8]。越来越多的研究表明，ctDNA在肿瘤的早期诊断、疗效评估、复发监测及预后判断等方面具有重要意义。Rolfo等[9]认为血浆中循环细胞肿瘤DNA的分离和分析技术是一种强大的工具，具有巨大潜力，可以改善包括NSCLC在内的多种癌症类型的临床结果。陈学瑜[10]等使用突变扩增阻滞系统法检测77例NSCLC患者外周血ctDNA与肿瘤组织中EGFR基因突变情况，结果发现NSCLC患者外周血ctDNA与肿瘤组织中EGFR基因突变率、突变位点比较均无明显差异，认为NSCLC患者ctDNA中EGFR基因突变与肿瘤组织中EGFR基因突变具有较好的一致性，预后效果良好，可作为判断患者预后的重要预测指标。

肿瘤的发生发展是一组多基因突变、多阶段的综合病理过程，是多种基因表达及积累的结果，而凋亡基因的改变是其中一个非常重要的环节[11]。人类Survivin基囚定位于第17对染色体的q25带，长度为75～130 kb，包含多个转录起始位点，具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂双重功能，在多数癌组织中均有表达，通过直接促进细胞逃离生长监控，造成细胞增殖增加，凋亡减少，二者之间的平衡被打破，最终导致肿瘤的发生[12]。Duan等[13]进行了Survivin蛋白表达参与亚洲人非小细胞肺癌进展的荟萃分析，该荟萃分析共纳入28篇文献，结果表明，NSCLC患者和正常对照之间survivin阳性表达存在显着差异，且survivin表达与组织学分化、肿瘤分期和淋巴结转移相关，认为Survivin表达与NSCLC的临床病理特征有关，可能是NSCLC进展的重要生物标志物。

本研究根据ROC曲线分析确定了NSCLC患者外周血ctDNA和Survivin mRNA表达水平界限值分别为17.23 ng/mL、5.34×105copies/mL，单因素分析显示，术后是否化疗、p-TNM分期、ctDNA与Survivin mRNA表达水平均是影响NSCLC患者预后的相关因素，Kaplan-Meier生存曲线分析显示，外周血ctDNA表达水平≥17.23 ng/mL、Survivin mRNA表达水平≥5.34×105copies/mL患者3年累积生存率均高于ctDNA表达水平<17.23 ng/mL、Survivin mRNA表达水平<5.34×105copies/mL患者，再次表明外周血ctDNA及Survivin表达情况与NSCLC患者的预后关系密切。原因在于，ctDNA是肿瘤细胞释放到血液中的单链或双链DNA，携带有原始肿瘤的突变基因，可用于监测患者术后微小病灶的残留，并评估肿瘤复发的相关风险，故可作为预测NSCLC患者预后的分子指标[14]。Survivin蛋白表达越高，其对癌细胞凋亡抑制的能力越强，癌细胞的生存能力也相应增强，导致肿瘤复发和淋巴结转移，预后较差，因此可作为预测NSCLC患者预后的分子指标[15]。此外，本研究COX多因素分析显示，p-TNM分期、ctDNA表达水平、Survivin mRNA表达水平均是影响NSCLC患者预后的独立危险因子，再次表明外周血ctDNA与Survivin mRNA表达水平与NSCLC患者预后具有密切关系。

综上所述，外周血ctDNA与Survivin均在NSCLC患者中高表达，与患者预后关系密切，可作为预测患者预后的分子指标。但本研究仅对ctDNA与Survivin单独预测作用进行分析，后续需行大样本、多中心的临床试验，以进一步评估多种指标联合检测在预测NSCLC患者预后方面的效能及价值。