氧化石墨烯对藻类的毒性作用研究进展*

王仁君， 辛佳艺， 陈峻峰

(曲阜师范大学生命科学学院，273165，山东省曲阜市)

0 引 言

氧化石墨烯(Graphene oxide)是石墨烯的氧化物，是由化学氧化的石墨粉末分离得到的单一原子层，是一种sp2杂化轨道的碳原子组成的六角型呈蜂巢晶格的二维碳纳米材料. 2010年的诺贝尔物理学奖授予了研制出微机械剥离法的英国曼彻斯特大学物理学家安德烈·盖姆和康斯坦丁·诺沃肖洛夫，他们应用微机械剥离法成功从石墨中得到石墨烯[1]. 石墨烯的特点是在本身低浓度无明显毒性的情况下，可与其他物质结合，通过复合物的形式而显现出毒性[2]. 氧化石墨烯含有较多的含氧官能团，化学性质活泼，表面活性和亲水性均较高，在电学、光学等方面的独特性质使其被应用于多个领域[3]. 因其能均匀分散在纯水中形成胶体溶液，加大了去除的难度，对水环境造成了一定影响[4]，同时易与其他物质结合从而对水体中的藻类产生一定影响.

1 研究现状

1.1 氧化石墨烯的应用

氧化石墨烯的制备方法灵活，并且具有较大的比表面积以及优异的亲水性能，使得其与材料复合更有利于发挥作用，近年来在生物医药、光催化和环境等方面应用较为广泛. 氧化石墨烯负载涤纶织物对染料有更高的去除率[5]；改性的氧化石墨烯应用于金属涂层中可减少涂层的缺陷，提高其防腐蚀能力[6]；有机染料和重金属等物质与氧化石墨烯复合后可改善吸附性能；氧化石墨烯与常见的抗菌剂如金属离子、聚胍和纳米粒子等复合后可提高抗菌性能；氧化石墨烯还可应用于增强材料的机械性能，例如氧化石墨烯能够调整水泥水化产物的微观结构使其更利于实际生活的应用[7].

1.2 氧化石墨烯的水环境行为

石墨烯可分为纯石墨烯、氧化石墨烯、还原性氧化石墨烯和少层石墨烯. 纯石墨烯的化学性质稳定，难以在水中被降解. 氧化石墨烯化学性质活泼，受到自然水体中pH值、离子强度、光照等理化性质的影响，会出现吸附、还原、分散、团聚等现象[8]. 氧化石墨烯的毒性和生物效应受表面理化性质的影响，氧化石墨烯可通过作用于细胞膜的结构以及有相关功能的蛋白质而导致细胞膜结构的变化和功能的异常[9]，从而对生物产生毒性.

随着氧化石墨烯的兴起与大量使用，在自然水体环境中也出现了氧化石墨烯的身影，而藻类在水体中占据着重要的地位，因此氧化石墨烯在水环境中对藻类的影响成为了不容忽视的问题. 研究表明，氧化石墨烯的浓度、暴露时间、在水中分散的稳定性[10]和对物质的吸附[11]等因素都会直接或间接地对水中藻类造成影响.

2 氧化石墨烯对藻类的毒性作用

2.1 氧化石墨烯对藻类生长状况的影响

藻类的生长状况所受影响主要是藻密度和EC50.

涂海峰等[12]对青岛大扁藻(Platymonashelgolanidicavar.tingtaoensis)藻密度受氧化石墨烯暴露时间的影响进行了研究，结果表明低浓度(0.1～10 mg/L)氧化石墨烯暴露的前72 h 略微促进了扁藻密度的升高，藻密度稍高于空白对照组；暴露96 h过程中，低浓度的氧化石墨烯对青岛大扁藻的生长有略微的抑制作用，抑制率低于10%，在整个暴露过程藻密度没有受到明显的抑制，可见青岛大扁藻对氧化石墨烯的耐受性较强.

张倩等[13]的研究比较了氧化石墨烯对盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)和海水微绿球藻(Nannochloropsisoceanic)生长状况的影响，两种藻的生长均受到显著的抑制作用，其中盐生杜氏藻受生长抑制较为严重，氧化石墨烯暴露24 h后藻类几乎停止生长，72 h EC50值低至13.04 mg/L，而海水微绿球藻72 h EC50值为79.10 mg/L.

Ji等[14]研究表明不同浓度氧化石墨烯对小球藻(Chlorellavulgaris)作用24 h时藻细胞分裂增加，表现为促进藻的生长；作用96 h时藻细胞分裂下降，对藻生长起抑制作用.

斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)分布广泛，有丰富的蛋白质[15]，湖泊微拟球藻(Nannochloropsislimnetica)也是许多水生动物的食物[16]. 彭晓玲等[17]研究发现在氧化石墨烯暴露24 h之内，不同浓度的氧化石墨烯对藻细胞的生长均无明显抑制；在24 h后，两种藻的生长均受到抑制，氧化石墨烯浓度高的实验组相对于浓度低的实验组抑制程度更高. 氧化石墨烯对斜生栅藻72 h 的EC50为25.63 mg/L，对湖泊微拟球藻72 h的 EC50为48.44 mg/L，根据我国《新化学物质危害评估导则》(HJ/T154-2004)[18]提出的生态毒理学危害性分级标准，氧化石墨烯对这两种藻类属于中等毒性.

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王艳秋[19]研究了不同浓度氧化石墨烯对铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)生长的影响，研究表明低浓度(0.1 mg/L，1.0 mg/L)氧化石墨烯的实验组中，暴露的前24 h内藻的密度与对照组大致相同，对藻的生长状况未造成明显影响；氧化石墨烯暴露48 h后，实验组的藻密度较之于对照组明显降低，藻的生长受到显著抑制；高浓度(10 mg/L)的氧化石墨烯在整个暴露过程中对藻密度均起到明显的抑制作用.

综上实验结果可知，在低浓度(10 mg/L以下)氧化石墨烯暴露短时间(24 h以下)的情况中，藻的生长受到一定的促进作用或无显著变化(见表1)；高浓度(10 mg/L及以上)暴露长时间(24 h及以上)时，藻类的生长会受到显著抑制. Yin等[20]比较了氧化石墨烯对绿藻、蓝藻和硅藻的毒性，发现氧化石墨烯对藻类的毒性作用程度因藻的种类而异，即藻类具有不同的特性所表现出不同程度的遮光效应、氧化应激和机械损伤等现象，能承受氧化石墨烯胁迫的浓度与时间不同，因而表现出不同的耐受性.

表1 氧化石墨烯(浓度为0.1～10 mg/L)对藻密度的影响

2.2 氧化石墨烯对藻类微观结构的影响

研究发现氧化石墨烯在抑制藻生长的同时，也使藻的微观结构发生了一定程度的变化，较高浓度氧化石墨烯的暴露使藻细胞的形状变得不规则[17]，氧化石墨烯是单一原子层的片层结构，厚度约为0.8～1.0 nm的氧化石墨烯边缘通常比较尖锐，会直接对细胞壁和细胞膜造成损害，如划破、刺穿细胞膜等[21]. 氧化石墨烯与藻接触时，在藻细胞周围形成了一层涂层，细胞壁由于氧化石墨烯的附着和刺穿变得轮廓模糊，出现了质壁分离、叶绿体收缩的现象[17]，同时使细胞膜的完整性受到破坏，细胞膜的完整性在一定程度上可以由细胞膜的通透性来表示，在对青岛大扁藻的研究中，实验人员用FDA法实测荧光强度与藻细胞数目的比值来反映藻细胞通透性的状况，结果表明氧化石墨烯的暴露会使藻细胞膜的通透性呈现升高的趋势，而且氧化石墨烯浓度越高、暴露时间越长，细胞膜通透性的改变程度越大[12].

2.3 氧化石墨烯对藻类细胞内活性物质含量的影响

2.3.1 细胞内的叶绿素含量

在针对青岛大扁藻氧化石墨烯暴露的96 h过程中，不同浓度的氧化石墨烯对青岛大扁藻的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量没有明显影响，仅叶绿素a含量略微降低，其降低程度与空白组对照并不明显，且叶绿素含量变化均与青岛大扁藻的生长情况一致，这表明了氧化石墨烯对青岛大扁藻为低毒性[12]. 这与Tang等[22]研究氧化石墨烯对铜绿微囊藻叶绿素含量的影响作用结果相似，浓度低于10 mg/L的氧化石墨烯对藻的光合色素参数(包括叶绿素a含量)无明显影响. 但王艳秋等[19]将铜绿微囊藻暴露在氧化石墨烯与氧化石墨烯量子点中时，结果表明在0.1～10 mg/L浓度范围内的纳米材料便能引起铜绿微囊藻叶绿素含量的大幅增加，此实验组中所用纳米材料直径为 20～50 nm，Tang等使用的氧化石墨烯水悬浮液的平均水动力直径为588±5 nm，两结果不一致的原因可能为两实验组所用氧化石墨烯纯度、直径、形状等性质不同，使得氧化石墨烯的生态毒性有所不同[23]. 而斜生栅藻的光合色素受氧化石墨烯影响较为明显，在与对照组的比较中，低浓度(10 mg/L)氧化石墨烯的处理组中藻光合色素的含量会显著升高或无明显变化，高浓度(100 mg/L)处理组中藻光合色素含量一般会明显降低[13].

综上实验结果可知，高浓度(10 mg/L以上)的氧化石墨烯可引起藻细胞内叶绿素含量的大幅增加，这是由于氧化石墨烯附着在细胞表面而产生遮蔽效应，使得藻细胞对光的利用减少[24,25]，为了维持光合作用的水平，此时会产生一种应激效应，细胞内的负反馈机制使得保护性基因表达从而产生更多的叶绿素，增加对光的吸收，提高对光的利用能力[23,26]. 而在高浓度实验组中，氧化石墨烯含量增大超出了藻细胞可自我调节的范围，使叶绿体结构遭到破坏，体积缩小，光合色素分子受损或者合成代谢受阻，对藻的光合作用产生了抑制[27]. 结果同时表明光合参数可用于测定氧化石墨烯对藻的毒性效应[22].

蛋白质是藻细胞正常生理功能的物质保障，其含量变化可反映藻细胞受损情况[28]；藻细胞内的总脂不仅构成了细胞膜的主要组分,也是细胞能量和碳的储存库[29,30]；当微藻在不利环境下生存时，藻细胞生长会受到抑制，胞内有机物积累，使碳水化合物的含量升高[31]. 因此细胞内蛋白质、总脂和碳水化合物含量的变化可反映藻细胞受不利环境影响的程度.

在比较斜生栅藻和湖泊微拟球藻的实验中，对于藻细胞内部的成分，两种藻的总蛋白质含量在不同浓度氧化石墨烯胁迫下均呈现增加的现象. 低浓度(10 mg/L)实验组中，两种藻的碳水化合物含量均上升，且只有湖泊微拟球藻的总脂含量明显上升；高浓度(100 mg/L)实验组中，两种藻的总脂含量均明显上升，斜生栅藻的碳水化合物含量降低，湖泊微拟球藻的碳水化合物含量升高[17].

张倩[13]将两种海水藻——盐生杜氏藻和海水微绿球藻分别置于氧化石墨烯浓度为0 mg/L，10 mg/L和100 mg/L的培养基中处理72 h后，蛋白质含量和总脂含量均表现为显著增加，随着氧化石墨烯浓度的升高，藻体内的总脂含量以及蛋白质含量均显著高于对照组，其中海水微绿球藻在高浓度(100 mg/L)的氧化石墨烯处理中表现为总脂含量比对照组增加了3.56倍，蛋白质总量比对照组增加了3.99倍. 在藻细胞内碳水化合物含量的测定中发现，盐生杜氏藻在氧化石墨烯低浓度组处理下碳水化合物含量升高，高浓度组含量降低，而海水微绿球藻细胞内碳水化合物含量无显著变化(见下页表2).

表2 氧化石墨烯对藻类细胞内活性物质含量的影响

综上实验结果可知，一定浓度范围内的氧化石墨烯能够使藻细胞内蛋白质、总脂和碳水化合物含量增加，以提供能量来产生具有保护性的酶和化合物，以此适应胁迫[32]，对细胞的生理代谢功能的影响较为重要；当氧化石墨烯浓度过高时，会影响一些藻类碳水化合物的合成或与碳水化合物反应而破坏其结构，致使碳水化合物含量降低[13].

3 存在的问题

研究者在氧化石墨烯对藻类的毒性作用方面已经进行了大量研究并取得了重要成果，但目前氧化石墨烯对生物的致毒机理并不太明确，在更高水平上对氧化石墨烯的研究仍然存在着许多空白.

(1)氧化石墨烯与金属等物质对藻类的联合毒性研究较少，氧化石墨烯在天然水体中的毒性以及与其他污染物的联合毒性都可能发生变化，氧化石墨烯的暴露对水中其他生物如无脊椎动物、鱼类等也具有一定影响[33,34].

(2)由于氧化石墨烯氧化制备方法的差异，各实验环境与所用氧化石墨烯的理化性质不尽相同，其研究结果就会存在差异甚至相反. 比如Malina等[35]的研究表明氧化石墨烯氧化程度的差异对细胞膜完整性的影响差异较大，主要表现为氧化程度较轻的氧化石墨烯样品对膜完整性的损伤明显大于氧化程度较高的样品，原因是高氧化程度的氧化石墨烯广泛的表面功能化阻止了与细胞膜的直接物理相互作用. 除此之外，氧化石墨烯的性质差异还表现在片层的厚度和形状、表面电荷、表面含氧官能团的种类及数量等方面，因此氧化石墨烯理化性质的差异性给其毒性效应的评估带来了困难.

(3)现阶段大多数研究是在实验室条件下进行的，而在实际水体环境中氧化石墨烯的转化是多样的. 比如Zhao等[36]的研究发现光转化使得氧化石墨烯对小球藻的毒性显著升高，释放副产物增强了对藻细胞生长的抑制作用，表明光照也是改变氧化石墨烯毒性的因素之一. 所以在实际水环境中，水体的盐度、水的流动性、氧化石墨烯在可见光下的还原[37]、水中离子的转化和吸附等因素均有可能会随着时间的推移而改变氧化石墨烯的存在形式，影响其生态毒性. 自然条件下氧化石墨烯还可能与各种生物之间发生复杂的相互作用，这成为自然条件下进行氧化石墨烯毒性评估的一大阻碍.

4 研究展望

氧化石墨烯现今作为具有多种特殊性能的新型材料被广泛应用于多种领域，有着巨大的发展潜力. 比如被用作高效吸附材料来吸附水中有机和无机污染物质[38]，因其具有的生物相容性[39]和抗菌性等优良性状被用来制作有多种特殊性能的纳米材料[40]，氧化石墨烯与其他物质的结合更是拥有着广阔的发展前景. 随着氧化石墨烯的兴起与大量使用，其不可避免地进入到自然环境中，氧化石墨烯具有的强吸附能力、亲水性等性质，使其进入到土壤中、水体中难以被去除，对土壤中的秀丽隐杆线虫、潮虫、植物、水体中的鱼类和藻类产生一定的生物毒性[41]，对生态环境造成一定的影响.

对现阶段的研究进行总结和分析，未来研究可从以下几个方面开展.

(1)氧化石墨烯的吸附性能使其易于与有机物质、金属离子等物质结合而发生反应，从而使其生物毒性发生改变，所以需开展氧化石墨烯与不同物质组合对藻类产生联合毒性的探究.

(2)氧化石墨烯在自然水体中受环境物理条件、生物条件的影响可发生理化性质的改变，需进行氧化石墨烯在实际自然环境中的追踪，探究多因素影响下氧化石墨烯性质的变化，在更高水平上对其致毒机理开展研究.

(3)如何有效、快速地将氧化石墨烯从自然环境中分离出来、如何进行材料的循环再生以及妥善处理废弃的氧化石墨烯材料，也是现阶段亟待解决的问题.