生物有机肥DNBF32对黑土中阿特拉津消减及土壤细菌群落结构的影响

姜 昭，马月璇，闫轶文，王建民，刘 畅，佟姗姗，张智伟

（东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030）

阿特拉津作为一种三嗪类内吸选择性苗前、苗后封闭除草剂，在世界范围内玉米种植过程中广泛使用[1]。其对一年生禾本科和阔叶杂草以及多年生杂草具有较好防除效果。然而，阿特拉津同样具有明显的生物毒性。因此，长期摄入阿特拉津会损害动物或人体健康[2]。此外，由于阿特拉津具有长残留特性，进入环境后可在土壤及水体中残留并积累，进而对水生生物、敏感植物及土壤微生物造成负面影响[3-5]。由此可见，关注阿特拉津使用而产生的潜在生态风险并采用必要措施消减其在环境中残留尤为必要。

微生物修复技术被认为是一种高效、绿色的消减环境中有机污染物的技术方法。自20世纪90年代以来，已从世界范围环境样品中分离得到不同生长特性阿特拉津降解微生物[6]。然而，目前大多在实验室模拟条件下研究降解微生物对土壤中阿特拉津的去除效果，如何在田间原位条件下利用降解菌株消减农田土壤中残留的阿特拉津仍需探讨[7-8]。以功能微生物与有机肥为主要成分制备而成的生物有机肥在农业领域应用广泛，其在调节作物生长、控制土传病害等方面具有明显作用效果。凌宁等利用多粘芽孢杆菌、绿色木霉等拮抗菌株与猪粪堆肥为主要成分制备西瓜专用生物有机肥，有效实现防治西瓜枯萎病[9]。侯宗海通过基施生物有机肥，使小白菜株高、最大叶片宽明显增加，同时提升小白菜营养物质积累及单株鲜重[10]。然而，利用生物有机肥提升农田土壤中有机污染物消减的研究则相对较少[11-13]。

东北黑土区作为我国重要商品粮生产基地，在维持国家粮食安全方面发挥重要作用。然而该地区由于长期过度垦殖和不合理经营的管理方式，导致黑土出现质量退化及生产力下降等问题[14]，如何在保障东北黑土区农业生产规模与生产过程前提下，开展农田污染土壤修复与质量提升值得关注。研究表明，增加有机肥施用是改善土壤质量的有效措施，同时有机肥添加亦可调节土壤微生物群落结构，强化土壤中各类物质分解与转化过程[15-16]。为此，研究选取本课题组研发的具有阿特拉津消减功能的生物有机肥（DNBF32）为供试材料，重点分析其去除农田土壤中残留阿特拉津及调节玉米生长的作用效果，同时研究DNBF32对玉米田土壤中细菌数量及群落结构调控效果，旨在进一步探讨DNBF32消减阿特拉津与调节玉米生长的微生物学机制，相关研究可为生物有机肥在农业环境保护中的应用提供方法借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

田间试验在黑龙江省哈尔滨市阿城区舍利屯玉米农田开展。土壤类型为黑钙土，土壤基本性质为：有机质37.23 g·kg-1，全氮1.13 g·kg-1，全磷0.58 g·kg-1，全钾18.35 g·kg-1，速效磷39.53 mg·kg-1，碱解氮68.81 mg·kg-1，速效钾134.00 mg·kg-1，pH 6.12。

1.2 试验设计

本试验共设置4种不同生物有机肥施用量处理，施用量分别为0 kg·hm-2（CK）、75 kg·hm-2（SF75）、150 kg·hm-2（SF150）和225 kg·hm-2（SF225）。每个处理设置3个重复。开展田间小区试验，每个试验小区面积约104 m2（垄长约20 m，垄数为9垄，垄距为0.65 m）。种植玉米品种为绥玉18，种植模式为传统垄作，种植密度约为67 500株·hm-2。基肥为喜迎秋TM玉米专用复合肥（总养分≥52%，N-28，P2O5-14，K2O-10），基肥施用量折合纯氮（N）为180 kg·hm-2。DNBF32以追肥形式在上述试验田玉米封垄前（6月中旬）施用。DNBF32为黑龙江省土壤保护与修复重点实验室前期研制的固态生物有机肥，其固态基质为畜禽粪便堆肥、腐殖酸和草炭。活性微生物菌株为可降解阿特拉津功能菌株Acinetobactersp.DNS32，有效活菌数不低于0.2×108CFU·g-1。DNBF32主要养分含量为：总氮（TN）1.23%、总磷（TP）1.03%、总钾（TK）1.66%、有机质46.7%。

1.3 样品采集

分别于玉米播种前（5月）、玉米大喇叭口（7月）和成熟期（10月）采用蛇形取样法利用土钻采集表层0～20 cm土壤。将采集土壤样品装入自封袋迅速带回实验室，分析土壤生物学特征及测定阿特拉津浓度，并于成熟期考种测产。此外，本试验于玉米播种前（5月初，基肥以及除草剂均已投加）随机采集试验区域土壤样品代表试验前土壤（YS），样品采集方式同上所述。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 土壤中阿特拉津残留浓度测定方法

准确称取10 g风干土壤样品到100 mL三角瓶。利用甲醇-水为9∶1（体积比）溶液提取土壤中阿特拉津，并利用气相色谱仪（GC-2014，岛津，日本）测定阿特拉津含量[17]。

1.4.2 玉米生长及产量测定方法

成熟期测定各小区玉米行距及株距，计算株数和穗数[18]。随机选取20株玉米测定玉米株高、千粒重、穗粒数并计算玉米产量。

1.4.3 土壤中可培养细菌菌落总数测定

可培养细菌菌落总数测定采用张丽娟等方法[19]。称取10 g新鲜土壤样品置于装有90 mL灭菌蒸馏水的三角瓶中。置于恒温震荡器中摇匀处理30 min后静置。取1 mL上清液置于装有9 mL灭菌水的试管中，记作10-1稀释梯度菌悬液，并逐级稀释至10-6稀释度菌悬液备用。各稀释度菌悬液中可培养细菌群落总数采用平板技术法测定。吸取1mL菌悬液于LB培养基平板上，在无菌条件下涂布均匀后置于30℃生化培养箱中培养至菌落出现（1～2 d），按下列公式统计各处理可培养细菌菌落总数。

式中，A-每克干土含有可培养细菌菌落数（CFU·g-1）干土；C-同一稀释度平均菌落数（CFU）；n-稀释倍数；M-新鲜土壤质量（g）；T-土壤含水率（%）。

1.4.4 微生物群落测定方法

借助土壤微生物总DNA提取试剂盒获取供试样品DNA。对土壤中细菌16S rDNA基因序列V4～V5区作扩增。样品经纯化处理后利用Ⅰllumina MiSeq高通量测序平台序。通过对测序数据作生物信息学分析，明确各试验处理微生物群落特征差异情况。

1.5 数据统计与分析方法

数据统计分析软件为SPSS 19.0。不同处理间统计学差异分析采用单因素方法作分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 生物有机肥DNBF32对农田土壤中阿特拉津的消减

表1中数据表明，阿特拉津喷施后，试验区表层土壤中（YS）阿特拉津检测浓度为（1.48±0.32）mg·kg-1。本研究发现阿特拉津存在自然降解趋势，在玉米成熟期CK处理土壤中阿特拉津残留浓度为（0.73±0.18）mg·kg-1，显著低于YS土壤样品。DNBF32施用可减少玉米田阿特拉津残留浓度。在玉米大喇叭口期和成熟期采集样品中，随施用量增加，阿特拉津残留浓度显著下降。其中，在玉米成熟期时，SF150与SF225处理中已无阿特拉津检出。

表1 生物有机肥DNBF32施用对土壤中阿特拉津残留量的影响Table 1 Effects of microbial organic fertilizer DNBF32 on atrazine residue in soil

2.2 生物有机肥DNBF32对玉米生长的影响

表2中结果表明，DNBF32施用处理（SF75、SF150和SF225）玉米株高均高于未施用DNBF32对照处理（CK），说明DNBF32施用对玉米生长具有一定调节作用。此外，尽管DNBF32施用可提高玉米千粒重和产量，但与CK处理相比未达显著差异（P＞0.05）。结合DNBF32对农田土壤中阿特拉津去除效果，同时对比上述各施用量DNBF32对玉米生长性状（株高和千粒重）和产量的调控作用效果，当DNBF32施用量为150 kg·hm-2时，有助于较好协同实现阿特拉津消减与作物生长调控。

表2 生物有机肥DNBF32对玉米生长性状及产量的影响Table 2 Effects of biological organic fertilizer DNBF32 on growth characters and yield of maize

2.3 生物有机肥DNBF32对玉米田土壤可培养细菌菌落总数及细菌群落结构的影响

2.3.1 生物有机肥DNBF32对土壤可培养细菌菌落总数的影响

不同施用量生物有机肥DNBF32对玉米田土壤可培养细菌菌落总数影响如图1所示。玉米成熟期土壤样品（CK）与播种前土壤样品中（YS）可培养细菌菌落总数无显著差异，说明季节变化与玉米种植对农田土壤中可培养细菌菌落总数影响不显著。此外，随DNBF32施用量逐渐增加，土壤中可培养细菌菌落总数显著增加（P＜0.05）。

图1 生物有机肥DNBF32施用对玉米田土壤可培养细菌菌落总数的影响Fig.1 Effects of DNBF32 application on the total number of culturable bacterial colonies in maize field soil

2.3.2 生物有机肥DNBF32对玉米田土壤细菌群落结构的影响

不同生物有机肥（DNBF32）施用量条件下各处理土壤样品细菌多样性指数如表3所示。由表3可知，生物有机肥施用可改变土壤细菌群落多样性。SF150和SF225处理的Ace多样性指数和Chao多样性指数均明显高于其他处理，说明上述施用量的DNBF32对于土壤细菌多样性具有一定调节作用。

表3 生物有机肥施用条件下土壤细菌多样性指数Table 3 Soil bacterial diversity index under different bioorganic fertilizer application conditions

不同处理细菌群落结构PCoA分析结果如图2所示。成分1和成分2合计可解释80.61%总体变量，说明上述两个成分可反映各处理土壤样品细菌群落结构信息。生物有机肥施用量处理样点（SF75、SF150和SF225）位于成分2正半轴区域，而未施肥处理2个样点（YS和CK）位于主成分2负半轴，表明生物有机肥施用明显改变土壤细菌群落结构。另外，SF150与SF75和SF225处理在图2中位置存在差异，说明不同施用量DNBF32对玉米田土壤细菌群落结构调节作用存在差异。

图2 不同处理土壤样品细菌群落多样性PCoA分析Fig.2 PCoA analysis of bacterial community diversity of soil samples treated with different treatments

结合上述研究结果，由于SF150处理表现出较低的阿特拉津残留浓度与玉米生长状态，因此本研究借助Venn分析进一步研究SF150处理中独特存在的微生物种类及潜在功能。图3表明，与其他处理相比，SF150处理中有12个独有OTU，其中包括Chloroflexi菌属（可利用光能进行合成作用）[20]、Terrimonas菌属（具有对污染物菲降解的能力）[21]、Rhodospirillales菌目（具有产生乙酸及光合产能的能力）[22]。可见，适宜施用水平的DNBF32可在一定程度上调节玉米农田中功能微生物群落结构。

图3 不同处理土壤样品细菌群落结构Venn分析Fig.3 Venn analysis of microbial community structure under different bioorganic fertilizer application conditions

2.4 相关性分析

表4为本研究所涉及主要指标相关性分析。结果表明，有机肥施用量与土壤可培养细菌菌落总数及细菌多样性指数（Chao指数）呈极显著正相关（P＜0.01）。有机肥施用量与阿特拉津残留浓度呈负相关，说明有机肥施用有助于强化土壤中阿特拉津消减。此外，玉米田土壤中阿特拉津残留浓度与可培养细菌菌落总数和细菌多样性指数呈负相关。玉米产量与细菌多样性指数呈正相关，且与阿特拉津残留量呈负相关，但相关系数均相对较低。

表4 研究指标相关性分析Table 4 Correlation analysis of the researched indices

3 讨论

生物有机肥是将功能微生物与传统有机肥充分结合而形成具有特殊功能的肥料，其在具备传统有机肥料植物促生功能外，也因其特殊功能，在农业生产、植物保护等方面受到广泛关注。本实验室前期研究利用除草剂阿特拉津高效降解菌DNS32与牛粪堆肥等固体基质制备可强化阿特拉津消减的生物有机肥DNBF32。本研究进一步证实生物有机肥DNBF32在农田原位施用条件下（150和225 kg·hm-2）可使成熟期玉米农田土壤中无阿特拉津检出（见表1），说明DNBF32在农田原位条件下也具有较好强化阿特拉津消减的能力。此外，本研究发现施用量为150 kg·hm-2的DNBF32可使玉米株高和产量较对照处理分别提高7.64%和8.30%，说明DNBF32还可在一定程度上提高玉米千粒重和产量，调节作物生长。上述研究结果为实现农业生产同时，同步实现农田除草剂原位强化消减提出新尝试。

微生物在土壤物质循环与生态功能维持方面发挥重要作用。包括有机肥在内的外源物质对于土壤微生物数量及群落结构调节作用被认为是强化土壤生态功能重要途径。朱菲莹等研究发现，施用生物有机肥可使土壤细菌群落多样性较对照土壤相比略有增加，同时微生物群落结构变化有助于减缓西瓜枯萎病发生[23]。本研究发现DNBF32施用可使成熟期玉米土壤中可培养细菌菌落总数显著增加（见图1），同时结合DNBF32施用处理（150和225 kg·hm-2）Ace多样性指数和Chao多样性指数均明显高于其他处理（见表3），说明DNBF32对土壤可培养细菌菌落总数与细菌群落多样性具有明显正向调节作用。此外，基于韦恩图分析结果表明，与其他处理相比，代表Chloroflexi菌属、Terrimonas菌属等系列功能微生物的OTU仅在DNBF32施用量为150 kg·hm-2处理中发现，说明DNBF32施用有助于丰富或活化玉米田土壤生态功能（见图3）。刘艳霞等研究发现，抑制烟草青枯病型生物有机肥田间施用处理较对照处理相比细菌种类有所增加，显著提高拮抗菌数并提升土壤微生物群落功能多样性[24]。齐建超等发现，微生物菌剂与有机肥联合作用可使土壤微生物数量增加，多样性更为丰富，最终促进土壤中石油烃降解[25]。上述研究结果表明，生物有机肥调节土壤微生物群落结构是发挥其生态功能（污染物降解、土传病害防控等）重要途径。相关性分析结果进一步表明，有机肥施用量与土壤可培养细菌菌落数及细菌多样性指数（Chao指数）呈正相关，同时玉米田土壤中阿特拉津残留浓度与可培养细菌菌落数和细菌多样性指数呈负相关，上述结果进一步说明DNBF32施用可通过调节土壤细菌数量及群落结构强化阿特拉津消减。此外，尽管玉米产量与细菌多样性指数呈正相关，与阿特拉津残留量呈负相关，但相关系数均相对较低且与有机肥施用量无明显相关性。主要是由于本研究中DNBF32施用以消减除草剂阿特拉津为主要目标，同时结合玉米生产的农艺措施而以追肥方式施用，因此其对玉米生长调节作用并未达显著差异水平，但仍能表现出一定程度植物生长调节作用。综上所述，DNBF32通过调控土壤细菌群落结构强化除草剂阿特拉津消减，并对玉米产量也具有一定调节作用。此外，DNBF32对于土壤养分的调节作用在后续研究中仍需进一步关注与探讨。

4 结 论

生物有机肥DNBF32以追肥形式在田间施用可降低黑土区玉米田土壤中除草剂阿特拉津残留浓度，且残留浓度与DNBF32施用量呈负相关，当施用量为150 kg·hm-2以上时玉米成熟期农田土壤中无阿特拉津检出。上述投加水平的DNBF32对玉米株高与产量也具有一定正向调节作用。此外，DNBF32施用可提升玉米田土壤中可培养细菌菌落总数，调节土壤细菌多样性及细菌群落结构。相关性分析进一步说明DNBF32施用可通过调节土壤细菌数量及群落结构进一步强化阿特拉津消减。