GPC-1外泌体、CD82外泌体和CA19-9用于胰腺癌诊断的病例对照研究

郭怀斌，李凤飞，刘一璠，张万星，阚金龙

(1.河北省人民医院肝胆外科，河北 石家庄 050051；2.河北北方学院研究生学院，河北 张家口 075000；3.河北医科大学研究生学院，河北 石家庄 050017；4.邯郸钢铁集团有限责任公司职工医院外科，河北 邯郸 056001)

目前胰腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)的治疗效果不佳，最有希望改善PDAC预后的方法是早发现、早治疗[1]。检测外周血磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican-1，GPC-1)外泌体(exosomes)可用于早期发现并诊断PDAC[2]， GPC-1外泌体内有Kras突变基因编码的RNA片段[3]，原癌基因Kras突变是PDAC发病的重要原因[4]。分化抗原(cluster of differentiation，CD)82外泌体是一个新发现的PDAC标记物[5]；CA19-9是目前临床常用的PDAC相关血清学肿瘤标志物，但其在PDAC诊断中的敏感度和特异度还达不到期望[6-7]。本研究旨在探讨检测外周血GPC-1外泌体、CD82外泌体和CA19-9对PDAC的诊断价值。报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2017年6月—2018年6月于河北省人民医院诊断为PDAC患者(PDAC组)31例和慢性胰腺炎患者(CP组)22例。PDAC组男性16例，女性15例，年龄34 ～78岁，平均(60.32±9.69)岁;CP组男性16例，女性6例，年龄28～82岁，平均(55.5±17.87)岁。2组性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。PDAC纳入标准：胰腺肿物行活组织检查或手术切除后组织经病理确诊为PDAC。排除标准：①标本收取过程中出现溶血的标本；②二源性肿瘤患者。根据MELO SA的研究[1]，CP排除乳腺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤患者，PDAC;③二源性肿瘤患者。CP诊断参照中华医学会外科学分会胰腺外科学组的诊断标准[8]，排除乳腺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤患者。

本研究经河北省人民医院伦理委员会审批通过(批号：2017年科研伦理第131号)，所有纳入患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2样本采集 2组患者采集清晨空腹外周血5 mL，放到乙二胺四乙酸抗凝管中，30 min内利用超高速离心机2 000 r/min(半径6.4 cm)离心10 min，去除细胞，再用超高速离心机10 000 r/min(半径6.4 cm)离心30 min，去除细胞碎片，剩余血浆，置于4 ℃低温冰箱保存待测。

1.3分离外泌体 血浆于冰面上自然融化后，用×1的PBS缓冲液稀释后过滤(孔径0.22 μm)，滤液在4 ℃利用超高速离心机15 000 r/min(半径16.5 cm)离心 12 h，得到外泌体微球，再用×1的PBS缓冲液洗涤，在4 ℃利用超高速离心机15 000 r/min(半径16.5 cm)离心2 h，得到所需要的外泌体溶液。

1.4外泌体GPC-1抗原染色 采用免疫组织化学SP法，其基本原理为抗原抗体反应和化学显色原理。首先通过微球偶联外泌体(exosome)，再用GPC-1抗体免疫结合外泌体上的GPC-1蛋白，孵育荧光二抗。先取外泌体溶液标本100 μL，利用4 μm醛/硫酸盐乳胶微球偶联外泌体，随后利用anti-GPC-1抗体PA5-28055免疫结合外泌体上的GPC-1蛋白，最后孵育荧光二抗：滴加Alexa Fluor 488抗体(7.5 mg/L)，并使用显示剂显色。

1.5GPC-1外泌体和CD82外泌体测定 通过C6流式细胞仪检测偶联混合物的荧光强度，自动计算外泌体GPC-1和CD82外泌体阳性率[9]。

1.6CA19-9测定 依据河北省人民医院检验科检测结果。

1.7统计学方法 应用SPSS 22.0统计软件分析数据。非正态分布的计量资料组间比较采用非参数秩和检验。计数资料组间比较采用χ2检验。采用MedCalc v18.2.1统计软件绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线。相关分析采用Person相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.12组患者血浆CA19-9和 GPC-1外泌体、CD82外泌体表达比较 PDAC组CA19-9、GPC-1外泌体表达水平高于CP组，差异有统计学意义(P<0.05)。2组CD82外泌体表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组血浆CA19-9、GPC-1外泌体、CD82外泌体表达比较Table 1 Comparison of expression levels of serum CA19-9，GPC-1 exosome and CD82 exosome between two groups [M(QR)]

2.2CA19-9与GPC-1外泌体对PDAC的诊断价值 应用MedCalc统计软件绘制ROC曲线(图1)，CA19-9诊断PDAC的曲线下面积(area under curve,AUC)为0.771，95%CI:0.635～0.875，敏感度为70.97%，特异度为72.73%，误诊率为27.27%，漏诊率为29.03%。GPC-1外泌体诊断PDAC的AUC为0.918，95%CI：0.809～0.976，敏感度为90.3%，特异度为90.9%，误诊率为9.1%，漏诊率为9.7%。GPC-1外泌体对PDAC的诊断价值优于CA19-9(Z=2.462，P=0.014)。CA19-9与GPC-1外泌体联合诊断PDAC的AUC为0.922，95%CI:0.848～0.997，敏感度为83.9%，特异度为95.5%，误诊率为4.5%，漏诊率为16.1%。CA19-9与GPC-1外泌体联合诊断PDAC优于CA19-9独立诊断，差异有统计学意义(0.922比0.771，Z=2.745，P=0.006)；CA19-9与GPC-1外泌体联合诊断PDAC与GPC-1外泌体独立诊断差异无统计学意义(0.922比0.918，Z=0.664，P=0.645)。

图1 血浆CA19-9和GPC-1外泌体及两指标联合的ROC曲线

2.3Person相关性分析 PDAC患者外周血CA19-9与GPC-1外泌体无相关(r=0.237，P=0.200)。

3 讨 论

有直接证据表明,GPC-1外泌体可作为早期筛查PDAC的肿瘤生物学标记物[2-3]，然而其临床应用仍需要更多的临床实践去检验[9-12]，而且临床上PDAC常需与慢性胰腺炎相鉴别[13]，CA19-9是目前临床常用的PDAC肿瘤学标记物，但其诊断PDAC的特异度文献报道最高为70%～80%，而且在路易斯-X抗原阴性的人群不表达[9]，因此本研究希望通过比较GPC-1外泌体、CD82外泌体与CA19-9在两者鉴别中的作用，进一步提高肿瘤学生物学标记物在PDAC诊断中的价值。基于以往研究中，困扰外泌体在PDAC中的诊断价值主要是实验方法所导致的外周血中外泌体检测的不稳定性，以及其判定标准的差异[9]。因此，本研究建立了一种基于Python的标准化数据处理方法[9]分离及测定外周血中的外泌体，因此所得数据真实可靠。CD82外泌体与PDAC分化、侵袭性及预后密切相关[7]，与CA19-9作为术后监测PDAC复发及预后指标有同样的临床价值。本研究结果显示，PDAC患者的外周血中GPC-1外泌体含量明显高于慢性胰腺炎患者，同时它的检测效能明显高于CA19-9(ROC曲线下面积)，这与Xiao等[9]的结果相一致；PDAC患者外周血中CD82外泌体含量虽然也高于对照组，但是两组患者间的差异无统计学意义，而且它的检测效能明显不如CA19-9(ROC曲线下面积)，这与Xiao等[9]的结果不一致，可能是对照组的设定不一样导致的。本研究将慢性胰腺炎患者设为对照组，不同于其他关于外泌体对PDAC的诊断价值的研究将正常人或急性胰腺炎患者设为对照组[2-3,7,9-12]，而临床上PDAC常需与慢性胰腺炎相鉴别[1,13-15]，有研究认为慢性胰腺炎是PDAC的癌前病变[16-17]，因此鉴别PDAC与慢性胰腺炎的临床意义更大，而早期发现PDAC能显著改善PDAC的预后[18]。此外，关于CD82外泌体的结果与Xiao等[9]的研究结果不一致，也有可能与本研究样本量较小有关。

本研究结果显示GPC-1外泌体单独诊断PDAC的AUC为0.918，明显高于CA19-9(CA19-9单独诊断PDAC的AUC为0.771)(AUC在0.9以上表示诊断效率较高，而AUC 0.7～0.9表示诊断效率为中等)。而且，GPC-1外泌体单独诊断PDAC的AUC(0.918)与GPC-1外泌体联合CA19-9诊断PDAC的AUC(0.922)无差异。因此GPC-1外泌体对PDAC的诊断价值优于CA19-9，并且不劣于GPC-1外泌体联合CA19-9的诊断价值。

CA19-9是常用的PDAC相关血清学肿瘤标志物，但CA19-9不仅在PDAC中异常升高，部分慢性胰腺炎中也异常升高，而且CA19-9 的水平在高胆红素血症的条件下可能不够准确，此外，人群中约10%为路易斯抗原无产物型，不分泌 CA19-9，并且如果排除梗阻性黄疸因素的影响[5,19]，外周血中GPC-1外泌体的测定较CA19-9更具诊断价值，并且外周血中GPC-1外泌体的测定单独用于诊断PDAC时其诊断效率并不劣于两指标、三指标联合的诊断效率。另外根据本实验数据所得外周血中GPC-1外泌体的测定用于诊断PDAC的敏感度为90.3%，特异度为90.9%。目前检测外周血GPC-1外泌体含量的方法较多，想要得到稳定的检验结果，其方法复杂、费用高；其次，目前应用于临床的病例数量相对较少。因而GPC-1外泌体含量测定能广泛应用于临床早期诊断PDAC，像甲胎蛋白用于乙肝相关性原发性肝细胞肝癌那样量化诊断价值，还有很长的路要走[11,20]。

综上所述，外周血中GPC-1外泌体的测定对PDAC具有很高的诊断价值，优于CD82外泌体和CA19-9，GPC-1外泌体联合CA19-9可以提高诊断PDAC的特异性，降低误诊率。