育龄期女性MTHFR基因多态性观察及其与VitB12、Hcy、SFA的关系

孙 艳，强桂彦，李春玲

(河北省沧州市妇幼保健院产三科，河北 沧州 061000)

不良妊娠结局指正常妊娠之外的病理妊娠与分娩期并发症，常见的有早产、胎膜早破、新生儿窒息等，为产妇、新生儿的身心健康及生命安全带来了严重威胁[1]。目前国内外已有较多学者对不良妊娠结局发生率进行了报道，并指出产前焦虑、肥胖、高龄、被动吸烟等是不良妊娠结局的危险因素，同时也指出不良妊娠结局是多种因素共同作用导致的[2-4]。现阶段围孕期增补叶酸(serum folic acid，SFA)是避免不良妊娠结局发生的重要方式，但经过流行病学调查发现不同地区人群增补SFA效果也存在差异，因此有必要对育龄期女性相关遗传标记物的特征进行分析[5-6]。5,10 -亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)与甲硫氨酸合成酶还原酶(methionine synthase reductase,MTRR)是SFA代谢的关键酶，若酶活性降低会导致甲基供体缺失，同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)转化为甲硫氨酸也会出现障碍，易出现不良妊娠结局[7-8]。本研究对育龄期既往有不良孕产史女性MTHFR(C677T、A1298C)、MTRR(A66G)基因的多态性进行分析，探讨SFA代谢与MTHFR(C677T、A1298C)、MTRR(A66G)基因多态性间的关系，为育龄期女性妊娠结局的改善提供帮助，现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年4月—2020年4月我院收治的既往有不良孕产史的围孕期患者124例设为A组；另选取同期行孕期检查且既往无不良孕产史的围孕期产妇124例设为B组。A组年龄24～31岁，平均(27.43±2.43)岁；体重指数23～27，平均25.46±1.43；产次1～2次，平均(1.53±0.43)次；B组年龄24～32岁，平均(27.50±2.52)岁；体重指数 23～27，平均25.41±1.30；产次1～2次，平均(1.51±0.48)次。2组年龄、体重指数、产次差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

本研究经医院医学伦理委员会批准通过(伦理批号2017-22号)。

1.2纳入标准和排除标准 纳入标准：①均为于我院行孕期检查的围孕期产妇；②年龄22～35岁；③入院后由我科责任护士为其讲解本研究的目的及方法，均自愿参与，并签署知情同意书。排除标准:①伴有血液或免疫系统疾病；②伴有甲状腺疾病或系统性红斑狼疮；③有酒精依赖或药物滥用史；④有严重的心脑血管疾病或肝肾功能异常；⑤伴有妊娠期疾病，如妊娠期糖尿病、妊娠期高血压等。

1.3方法 ①MTHFR及MTRR基因检测：2组均在入院后以采样拭子采集口腔脱落黏膜细胞，经柱式抽提试剂盒(上海生工生物公司)提取DNA后以Taqman-MGB技术检测MTHFR(C677T、A1298C)、MTRR(A66G)的基因多态性，检测过程中所需相关仪器、试剂盒均由美国ABI公司提供；将20 mg/L的1 μL DNA模板、20×Taqman-MGB探针0.5 μL、2×Taqman Universal Master Mix 5 μL，投入仪器，每个反应体系总体积10 μL，反应温度调整为95 ℃，经10 min反应后92 ℃环境下变性15 s，60 ℃环境下退火1 min后进行20个循环，随后改变条件，89 ℃反应温度下反应15 s，于60 ℃下退火1.5 min后进行30个循环，最后在ABI 7900型荧光定量PCR仪读取反应终点，借助分析软件获得MTHFR(C677T、A1298C)、MTRR(A66G)基因的分型结果，Taqman-MGB探针设计见表1。②血清检测：2组均在入院后取清晨空腹静脉血3 mL，经3 000 r/min离心8 min后取上清液，使用ADVIA Centaur型全自动化学发光免疫分析仪以化学发光法检测维生素B12(vitamin B12,VitB12)、SFA水平，试剂盒由SIEMENS公司提供；使用Olympus AU5400性生化分析仪以酶循环法检测Hcy水平，试剂盒由四川迈克生物科技有限公司生产。

表1 Taqman-MGB探针设计Table 1 TaQman-MGB probe design

1.4统计学方法 应用SPSS19.0统计软件处理数据。计量资料比较采用t检验、单因素方差分析和LSD-t检验；计数资料比较采用χ2检验；相关性采用Spearman秩相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.12组MTHFR C677T基因型及等位基因分布分析 A组MTHFR C677T基因型CT、TT型及T等位基因分布检出率显著高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组MTHFR C677T基因型及等位基因分布分析Table 2 Distribution of MTHFR C677T genotypes and alleles between two groups (n=124，例数，%)

2.22组MTHFR A1298C基因型及等位基因分布分析 2组MTHFR A1298C基因型及等位基因分布差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 2组MTHFR A1298C基因型及等位基因分布分析Table 3 Distribution of MTHFR A1298C genotypes and alleles between two groups (n=124，例数，%)

2.32组MTRR A66G基因型及等位基因分布分析 2组MTHFR A66G基因型及等位基因分布差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 2组MTRR A66G基因型及等位基因分布分析Table 4 Distribution of MTRR A66G genotypes and alleles between two groups (n=124，例数，%)

2.42组血清VitB12、Hcy、SFA水平比较 A组Hcy水平显著高于B组，SFA水平显著低于B组，差异有统计学意义(P<0.05)，2组VitB12水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 2组血清VitB12、Hcy、SFA水平比较Table 5 Comparison of serum VitB12, Hcy and SFA levels between two groups

2.5A组不同MTHFR C677T基因型患者血清VitB12、Hcy、SFA水平比较 MTHFR C677T基因型CT、TT型Hcy水平高于CC型，SFA水平显著低于CC型，差异有统计学意义(P<0.05)，3种基因型VitB12水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表6。

表6 A组不同MTHFR C677T基因型患者血清VitB12、Hcy、SFA水平比较Table 6 Comparison of VitB12, Hcy and SFA levels in patients with different MTHFR C677T genotypes in group A

2.6血清VitB12、Hcy、SFA水平与MTHFR C677T基因型的相关性分析 经相关性分析证实血清Hcy水平与MTHFR C677T基因型CT、TT型呈正相关，血清SFA水平与MTHFR C677T基因型CT、TT型呈负相关(P<0.05)。见表7。

表7 血清VitB12、Hcy、SFA水平与MTHFR C677T基因型的相关性分析Table 7 Correlation analysis between serum VitB12, Hcy, SFA levels and MTHFR C677T genotype

3 讨 论

目前提高出生人口素质为妇女保健及计划生育工作的重点内容，而不良妊娠结局则是影响出生人口素质的重要原因，同时还会对产妇的身心健康带来严重的负面影响[9]。SFA能够参与到核酸、氨基酸、磷脂等代谢中，能够对细胞分化及其功能产生影响，若妊娠期间出现SFA缺乏则会导致细胞分化受阻、胎盘滋养层发育障碍，进而引发不良妊娠结局[10-11]。MTHFR(C677T、A1298C)、MTRR(A66G)基因为SFA代谢过程中所需的关键酶，当关键酶基因发生突变则会导致SFA缺乏，影响妊娠结局。基于此，本研究分别选取既往有、无不良孕产史的248例围孕期产妇，探讨育龄期女性MTHFR(C677T、A1298C)、MTRR(A66G)基因多态性及其与VitB12、Hcy、SFA间的关系，为改善妊娠结局工作的开展提供参考依据。

本研究结果显示，A组MTHFR C677T基因型CT、TT型及T等位基因分布检出率显著高于B组，且2组MTHFR(A1298C、A66G)基因型及等位基因分布差异无统计学意义，提示育龄期既往有不良孕产史的女性MTHFR C677T基因存在突变，MTHFR(A1298C、A66G)基因未发生突变。于玲等[12]研究指出山东临淄地区胚胎停止发育产妇及正常妊娠产妇MTHFR(C677T、A1298C)、MTRR(A66G)基因特点比较差异无统计学意义，本研究结果与之存在差异，笔者分析可能与地区及研究纳入样本量存在差异有关。邢金芳[13]研究指出，河南、淄博、广西及海南地区MTHFR C677T突变等位基因频率为62.1%、43.6%、39.1%、26.2%，从南至北呈降低趋势，认为不同地区的基因多态性分布存在明显差异。

A组Hcy水平显著高于B组，SFA水平显著低于B组，提示Hcy增高、SFA降低可能是出现不良孕产史的原因之一。Hcy为人体硫酸氨基代谢的重要中间产物，当Hcy呈现出高表达时会损伤内皮细胞功能，破坏凝血及纤溶系统，此时机体处于血栓前状态，可导致胎盘微血栓形成，增加产妇及新生儿的并发症[14-15]。SFA属于水溶性维生素，当机体出现SFA缺乏时可为产妇的胎儿带来伤害，增加习惯性流产、早产、低体重儿等发生率[16-17]。王榀华等[18]研究指出，不良妊娠结局产妇Hcy明显增高，SFA明显降低，且两项指标呈负相关，本研究结果能够与之相互印证。

A组MTHFR C677T基因型CT、TT型Hcy水平高于CC型，SFA水平显著低于CC型，表明MTHFR C677T基因突变与SFA缺乏关系密切，同时经相关性分析证实血清Hcy水平与MTHFR C677T基因型CT、TT型呈正相关，血清SFA水平与MTHFR C677T基因型CT、TT型呈负相关，因此对于MTHFR C677T基因型CT、TT型孕妇应及时增补SFA。SFA可参与到嘌呤、核苷酸等多种物质的合成中，而MTHFR又是SFA代谢所需的一种关键酶，编码中的氨基酸会由丙氨酸变为缬氨酸，可导致酶活性降低，导致血清Hcy水平异常，并形成不良妊娠结局，因此及时采取相应的措施，增补体内SFA，或可对SFA代谢情况进行改善，促使Hcy维持在正常状态，改善妊娠结局。与袁春雷等[19]、安妮等[20]研究结果基本相符。另外，在既往研究中王艳辉等[21]研究指出，被动、孕前吸烟，既往有流产史，贫血是引起不良妊娠结局的危险因素，郑玉等[22]指出，高龄、肥胖、既往有不良妊娠史也是育龄期女性出现不良妊娠结局的危险因素，因此对于育龄女性增补SFA的同时也应对引起不良妊娠结局的危险因素予以关注，以便于及时采取相应的措施改善妊娠结局。

综上所述，育龄期既往有不良孕产史的女性MTHFR C677T基因存在突变，CT、TT型血清SFA低于CC型，Hcy高于CC型，对MTHFR C677T基因型CT、TT型的育龄期女性及时增补SFA或可降低不良妊娠的发生率。