铁皮石斛种质资源与遗传改良研究进展

刘羽佳，陈堰珊，理 雅，3，徐炜俊，刘博婷，于白音

（1. 韶关学院 广东省粵北食药资源利用与保护重点实验室，广东 韶关 512005；2.韶关学院 英东生物与农业学院，广东 韶关 512005； 3.河南农业大学 农学院，河南 郑州 450046）

铁皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）是兰科石斛属多年附生草本植物，主要分布于中国热带和亚热带地区，在海拔800~1 500 m的悬崖或富含腐殖质和苔藓的树干上常年生长. 在铁皮石斛的茎和叶中共检测到649种不同的物质，其中以有机酸、氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物和黄酮类化合物为主，因此被誉为“中华九大仙草之首”［1］. 铁皮石斛干燥茎为中国药典历版收载的珍贵中药材，具有养阴生津、补脾益胃之功效，早在1987年铁皮石斛就作为濒危物种被《国家重点保护野生药材物种名录》收录［2］. 研究表明，铁皮石斛对肠胃病、心血管疾病、糖尿病、肿瘤、白内障等均有显效［3-5］.

近年来，受气候改变、生境破坏及过度采挖等影响，加之培育者对选育和改良品种缺乏理论依据，存在盲目引种、缺乏技术管理体系与质量安全保障等问题，严重影响了铁皮石斛种质驯化、良种选育、规范化栽培、安全使用以及产业的快速发展［6-7］. 笔者主要对铁皮石斛种质资源与遗传改良方面进行了归纳，并指出了铁皮石斛资源保护与利用、良种选育和种质创新等方面是未来的重点研究方向，以期为铁皮石斛野生资源的保护、开发与可持续利用及其产业的长期稳定发展提供借鉴和研究思路.

1 铁皮石斛种质资源概况

1.1 铁皮石斛重要农艺性状遗传多样性研究

铁皮石斛种质的遗传多样性主要体现在茎长度、茎粗细、茎形、茎节数、节距、茎秆色、叶形、叶面积、叶色等农艺性状上，其中茎形、节距、叶形和叶色为影响植株表型性状的4个主因子，对其居群分类与鉴别起关键作用；同时研究发现茎长度是其表型性状差异中数值最高的，因此茎长度可作为铁皮石斛品质筛选与良种选育的重要指标［8-9］.

铁皮石斛根据其生长形态分为直立、斜立和斜卧生长3种类型，也可根据不同植株表观形态和解剖结构分为F型“软脚”和H型“硬脚”2种类型，与H型相比，F型茎长度相对较短且质地柔软，具有较多糖类黏液，表皮细胞较薄且角质含蜡质丰富，外侧纤维群细胞较少，一般不具备下皮层组织，因此是加工铁皮枫斗的优质来源［10］. PCR序列检测显示，F型和H型分别在其ITS区第168个碱基位点和5.8 S区第4个碱基位点上存在显著差异，表明遗传差异是决定铁皮石斛表型性状的直接因素［11］. 另外，不同地域铁皮石斛茎秆色具有显著差异，浙江和福建以淡青色为主，云南和贵州以淡紫色为主，且不同地域其茎长度亦差异较大，表明种植环境和地理位置不同是造成铁皮石斛农艺性状表型差异的主要因素［9，12］. 不同居群铁皮石斛叶面积和数目存在较大差异，叶面积直接影响作物生长发育与开花结果，单片叶面积与叶长宽积之间呈显著线性关系，而叶片数与茎叶总面积呈幂函数关系，因此，可以利用F1代叶片数估计茎总叶面积，从而估计完整植株的叶面积，为科学筛选杂交植株提供依据和节省时间［13］. 此外，利用高通量表型成像技术，对铁皮石斛进行多形态指标如植株高度、水平幅宽、紧密度、投影面积和含水量等检测［14］，可以减少人为测量和主观判断带来的误差，以辅助筛选具有优质性状且适宜人工栽培的铁皮石斛优良品种. 由此可见，农艺性状表型差异可作为铁皮石斛种质分类、资源鉴定和良种选育的重要依据.

谭嘉娜等发现随着铁皮石斛植龄的增长，其茎长度、鲜叶重与分蘖数增加，茎长度、茎粗细和鲜叶重均与产量呈极显著正相关，分蘖数与产量呈显著正相关，但茎长度与鲜叶重没有明显相关性［15］，换言之，可以通过增加茎长度和茎粗细，提高鲜叶重与分蘖数，达到提高产量的目的. 另外，栽培环境对铁皮石斛生长发育和代谢物积累具有较大影响［16］，与设施盆栽相比，岩壁附生和梨树附生的铁皮石斛植株粗壮矮小，茎秆逐渐变为紫红色且根系发达，叶片稀疏、变厚，气孔变小而加密，但生物量较低［17］；岩壁附生的铁皮石斛多糖和醇溶性浸出物成分含量最高（且其醇溶性物质的化学成分最为复杂），梨树附生其次，设施盆栽居末［18］；铁皮石斛种质、种植方式、年限、产地以及形态特征均对铁皮石斛总生物碱含量有显著影响［19］.

1.2 铁皮石斛种质资源分子聚类分析

近年来，由于不同种源铁皮石斛在不同产地的混乱引种，致使铁皮石斛种质来源日渐模糊，利用分子标记技术进行聚类分析，能够较准确地获得铁皮石斛种内和种间亲缘关系及其遗传多样性信息. SSR多态性聚类分析显示，红褐色茎秆与绿色茎秆的铁皮石斛分别聚在相对独立的亚组［20］，这一结论与SRAP标记聚类分析结果一致，推测茎秆色与铁皮石斛的亲缘关系存在密切联系［21］. 然而，仅依靠单一农艺性状的差异或单一技术的聚类分析，难以对不同来源铁皮石斛进行准确区分［22］，必须采用多种分子标记技术相结合的方法来进行聚类分析，才能提高铁皮石斛种源间遗传多样性和亲缘关系分析的可靠性［23］.

铁皮石斛基因组内含有大量多态性较高的简单重复序列，使其自然种群具有相当丰富的遗传多样性［24］. 研究发现，我国铁皮石斛主要分布于浙江、江西、福建、云南、广东等南方地区，而不同地域分布的铁皮石斛种质间是否存在亲缘关系的相关性，得出的结果并不一致. 苑鹤等利用RAPD标记对14个居群的铁皮石斛进行聚类分析，结果表明铁皮石斛种质的亲缘关系远近与其地理种源具有显著相关性，与栽培地点无关［25］，利用RAMP和SSR标记对不同种源地铁皮石斛亲缘关系的多态性聚类分析也证实了这一结论［26-27］，而且随着方法的改进与人工栽培铁皮石斛范围的不断扩大，铁皮石斛的区域差异性有所减弱［28］；徐蕾等利用SSR标记进行遗传多样性聚类分析，结果显示位于同一居群的铁皮石斛来源地却不同，而遗传相似系数较大的同源铁皮石斛却被分配在不同居群，推测铁皮石斛亲缘关系与来源地缺少相关性［29］；Ding等通过ISS与RAPD标记技术分析了广东、广西、浙江等7省共9个铁皮石斛居群，发现居群内遗传多样性高达78%，同样暗示铁皮石斛居群间亲缘关系与地域分布缺乏直接相关联系［30］；此外，对比野生与人工栽培的铁皮石斛的遗传多样性，显示野生与人工栽培的铁皮石斛存在较远的亲缘关系，这可能意味着野生铁皮石斛的遗传多样性更为丰富，且群内的变异系数远大于群间变异系数［31］. 由此可见，野生铁皮石斛居群发生了严重遗传漂变，与过度采挖与源生地环境恶劣高度相关，因此迫切需要保护.

2 铁皮石斛遗传改良研究现状

2.1 杂交育种在铁皮石斛遗传改良中的应用

对具有亲本优良性状的植株加以人工培育以获得遗传相对稳定的新品种，是目前铁皮石斛育种最主要方法，可以有针对性地开发铁皮石斛新品种. 研究发现，铁皮石斛全同胞F1代家系的农艺性状相对稳定（半同胞的变异率较高），可以利用来获得稳定且遗传性状优质的家系植株［32］；人工异株授粉试验发现，杂交育种技术可以将铁皮石斛的结实率由自然授粉的2%显著提高至36%［33］. 杂交育种也是提高铁皮石斛多糖含量的有效手段. 章晓玲发现，同一环境不同种源的铁皮石斛，其多糖含量和醇溶性浸出物种类差异显著，多糖含量低的可借助含量高的遗传优势，通过亲本杂交显著提高子代多糖含量，表现出杂种优势［34］；同样地，F1代杂交铁皮石斛产量和主要农艺性状的杂种优势也明显，与表型因子相关的茎粗细、叶片数、叶长宽等量化指标与产量均显著相关［35］. 因此，结合对产量显著相关的农艺性状相关量化指标的监测［13］，可以在早期提高铁皮石斛杂交植株品种选择的效率.

2.2 诱变育种在铁皮石斛遗传改良中的应用

目前多采用物理射线和化学诱变剂等进行铁皮石斛诱变育种. 其中，137Cs γ射线诱变育种的铁皮石斛表型性状会明显改变：发育不良、叶片缺绿、老化提前、产生非整数倍植株但多糖含量变化不大［36］，随着辐射剂量增加突变率上升、存活率下降，证实诱变育种存在突变方向不受控、有用突变频率低等［37］；人工模拟UV-B辐射诱变的铁皮石斛叶片焦黄、掉叶，多糖、黄酮、生物碱等含量增加，但来源不同的植株表现多样［38］. 空间诱变技术也是铁皮石斛育种的有效方法，徐靖等利用太空强辐射、高真空等特殊环境，将杂交的F1代铁皮石斛蒴果进行航天搭载，获得了适应性强、抗逆性好、产量高的新品种“仙斛3号”［39］. 常用化学诱变剂秋水仙素（也可用烷化剂或核酸碱基类似物）能将铁皮石斛诱变为多倍体，使得代谢加快、抗逆性强、产量增益［40-41］，但铁皮石斛不同组织器官对秋水仙碱的耐受不同［42］.另外，铁皮石斛多倍化不仅可以改变植株形态，也可增加植株多糖含量［43］：吴睿发现铁皮石斛四倍体多糖含量比二倍体增加了30.34%，多糖合成相关基因相对表达量均呈上调变化，其中PEPC显著上调［44］. 因此对以多糖为主要药用成分的铁皮石斛而言，加大诱变多倍化对多糖、生物碱等的影响研究，对铁皮石斛优质品种选育意义重大.

2.3 基因工程技术在铁皮石斛遗传改良中的应用

杂交育种是转移筛选后亲本的基因链，而基因工程育种则是直接转移基因片段并在植物体内有效表达出相应产物，可以精确对植株进行基因改良［45］. Zhang等成功完成了铁皮石斛全基因组测序和全基因组基因图谱绘制，为铁皮石斛分子水平分析、基因功能鉴定和生理生化效应研究奠定了基础［46］.

目前应用于铁皮石斛基因工程育种的方法主要以农杆菌介导法、基因枪法和花粉管通道法为主，并都以研究适宜转化条件来提高转化率为关键［47］. 如崔波等建立了铁皮石斛原球茎的农杆菌介导法遗传转化体系，为铁皮石斛新品种的开发奠定了良好的基础［48］；张振华等利用农杆菌介导法成功将建兰花叶病毒外壳蛋白表达载体导入石斛类球茎，育成抗病毒石斛新品种解决了建兰花叶病毒对石斛植株造成的叶片发育不良、开花不正常等问题［49］；武荣花等利用农杆菌介导法将1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶反义基因导入铁皮石斛原球茎，获得的新植株可减少乙烯合成、抑制开花进而提高铁皮石斛品质［50］；基因枪转化技术能够将大麦抗旱耐盐基因嵌入铁皮石斛植株基因组中，使耐盐性增强、育种效率提高、育种周期缩短［51］；冼康华等利用花粉管通道法将绿色荧光蛋白基因（GFP）和β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）转入铁皮石斛基因组中，在成熟的转化种子中检测到GFP和GUS基因表达信号［52］.

由此可见，基因工程育种对铁皮石斛遗传改良具有转化效率高、遗传稳定性好、可转化较大基因片段的优势，可培育优质高产、抗逆性强的药用优良品种，不再受育种周期长、结果不可测等因素的限制.

2.4 分子标记技术在铁皮石斛遗传改良中的应用

利用分子标记技术与分子设计育种能提高铁皮石斛品种鉴别［53］和亲缘关系分析的准确性［54］. 研究发现，石斛属叶绿体DNA中LSC区的psbK-psbI序列在不同石斛种间均存在差异，可作为石斛属鉴别的内参基因［55］. 徐慧君用RT-PCR结合ARMS方法对铁皮石斛和其他石斛的枫斗进行区分，能有效减弱石斛多糖含量高对DNA多态性条带扩增的干扰［56］. 同时，应用分子标记技术可对不同来源铁皮石斛进行遗传多样性和亲缘关系分析. 曹奕鸯等研究发现，与其它石斛属植物相比，福建泰宁野生铁皮石斛叶绿体DNA rps 16序列变异较大，多样性较高，其中T2型、T65型、D5型是泰宁野生铁皮石斛独有的DNA rps序列，推断泰宁是福建与周边野生石斛发源地之一［57］.

由于种质丰富的遗传多样性、人工种植工序繁琐极可能产生种质混杂，加之忽视选育，铁皮石斛已产生了多种遗传变异类型，容易导致栽培整齐度差、产量低、品质不稳定［58］. 因此，今后铁皮石斛选育应考虑但不限于以下方面：一是完善人工栽培大幅提高种质纯度；二是多利用ISSR、TRAP、SSR等分子标记技术来区分野生还是人工品种［27，59］，并准确鉴别品种来源地区［24，60］.

3 研究展望

近年来，野生铁皮石斛的种质资源日渐减少、种质来源日渐模糊、中药临床疗效减退、用药安全堪忧. 那么，采取何种措施才能有效保护铁皮石斛种质资源，实现该产业的快速发展呢？目前已有研究多是从种质资源的某一或两个方面进行剖析，实际上种质资源的保护与利用必然是辩证统一、相互依存、协同发展的，因此，有关铁皮石斛的种质资源收集、质量评价体系、栽培技术标准等方面的规范化管理策略构建，以及重要性状精准鉴定技术和优良种质发掘利用等的研究亟待加强，挖掘多种分子标记技术协同优化的聚类分析方法更需系统深入研究. 目前铁皮石斛种质选育多为传统的选择育种和杂交育种，而以基因工程技术和分子标记技术为核心的生物育种技术已逐步得到应用；随着铁皮石斛全基因组基因图谱绘制完成，生物育种（包括转基因育种、分子标记育种、分子设计育种等）技术能提高育种的精确性、高效性、可控性和预见性，并已为加快兰科植物的发育速度和种质的快速识别与鉴定提供了可能性［7，61］. 因此，铁皮石斛的资源利用和种质创新需加强基因功能方面研究，并从分子水平阐明功能基因的表达模式及其生长调控机制. 此外，代谢组学研究表明，铁皮石斛茎和叶上的代谢物质相似，且叶片含有较高水平脂质含量［62］，可对叶片和花朵进行开发利用与安全性评价研究，充分挖掘铁皮石斛各器官的药用功效.

建议在铁皮石斛种质资源保护与生物育种实践方面，今后需加大以下几方面的研究：（1）根据不同种源地野生铁皮石斛所处的生态环境，按其生物特性、环境适应性与生境破坏程度对种质进行就地保护、迁地保护或发展人工栽培技术；（2）尽可能收集来自不同种源地铁皮石斛资源，建立本地基地，加强对野生铁皮石斛的驯化，建立种质信息管理系统，共享铁皮石斛种质资源；（3）提高铁皮石斛种植业的培育技术标准，选育适合本地栽培的优良品种，保证铁皮石斛的药用品质与种植效益；（4）加速推进铁皮石斛功能基因研究，揭示种间与种内遗传物质的流向，构建遗传连锁图谱，为优良新种的选育奠定坚实基础.