鹅星状病毒的研究进展

李盈，郭旭

（海南保亭黎族苗族自治县畜牧渔业服务中心，海南 保亭 572300）

鹅星状病毒(goose astrovirus, GoAstVs)是一种以引起鹅内脏和关节中尿酸盐沉积为特征的新型病毒。近年来，有关该病毒感染鹅的病例逐渐增多，在我国许多省份造成了鹅产业的巨大经济损失。加强对鹅星状病毒的研究对于防治小鹅痛风等疾病具有重要意义。本文主要从病原学、临床特征、流行现状、诊断检测技术、防控技术等方面进行综述，旨在为进一步研究星状病毒提供参考依据。

1 鹅星状病毒概述

1.1 星状病毒特征

星状病毒(astrovirus,AstVs)可感染人类、哺乳动物、禽类等多种动物。最早于1965年从仔鸭中被发现，1984年被正式命名为星状病毒[1，2]。星状病毒属于星状病毒科，是一种无包膜的单链阳性RNA病毒，表面有明显的星状突起[3]，病毒颗粒直径为28~30 nm, 基因组长度因物种而异，范围为6.4~7.9 kb，包括5’端非编码区、3’端非编码区和三个开放的阅读框架（ORF1a, ORF1b,ORF2）。ORF1a和ORF1b编码非结构蛋白，二者之间包含高度保守的基因序列。ORF2编码病毒粒子形成所需的病毒衣壳蛋白[4]。病毒衣壳蛋白又包含一个保守的衣壳核和一个可高度变异的刺突结构域。该刺突结构域极有可能是宿主抗体的靶点。另外，ORF2的氨基酸序列被用作星状病毒分类的基础。ORF2中氨基酸序列的同源性大于75%的被归为同一种星状病毒[5]。

1.2 星状病毒分类

星状病毒可根据感染哺乳动物和禽类的能力，分为哺乳动物星状病毒属（Mamastrovirus, MAstV）和禽类星状病毒属（Avastrovirus, AAstV）[6]。哺乳动物星状病毒主要感染人类、绵羊、猪、牛、老鼠、猫、犬等哺乳动物，禽类星状病毒主要感染鸡、鸭、火鸡、鸽子、鹅等禽类。但是这种基于宿主类群的分类似乎并不准确，对星状病毒遗传和进化的研究表明它们有跨越物种屏障、适应新的宿主和物种的潜力[7]。星状病毒的遗传变异和跨物种传播存在人畜共患感染的风险。

1.3 鹅星状病毒特征

鹅星状病毒(goose astrovirus, GoAstVs)于2005年在小鹅痛风病例中被发现[8]，2016年11月在山东被发现，这是首次在我国发现鹅星状病毒，其基因组长度为7.2 kb[9]。ORF2编码的衣壳蛋白（Cap蛋白）是鹅星状病毒唯一的结构蛋白，在感染环节参与了病毒吸附及复制，且是GoAstV的主要抗原区域，能介导病毒入侵宿主细胞，是研究的重点[10]。

目前发现鹅星状病毒有GoAstV-1和GoAstV-2两种基因型，均可导致雏鹅痛风的临床症状[11]。研究证明，GoAstV-2基因型对1~15日龄的雏鹅具有高致病性，但对25~35日龄的雏鹅仅造成轻微症状[12]。GoAstV-1和GoAstV-2两种基因型可以共同存在于一个宿主体内，出现协同作用，发病频率略高于GoAstV-1[13]。WANG A P等[14]实验感染雏鹅，结果显示GoAstV-1和GoAstV-2阳性率分别为36.36%和54.55%，两种病毒合并感染率为21.21%。另外，GoAstV也可在家禽、水禽之间跨物种传播[15，16]，也可以在鹅体内垂直传播[17]。引起鹅痛风的GoAstV-2大约在2010年出现，而GoAstV-1出现得比GoAstV-2早，估计在1985年4月已出现，基于贝叶斯分析，GoAstV的平均进化速率约为每年每个位点发生1.42×103个核苷酸替换[18]。

2 临床症状

鹅星状病毒主要感染3周龄以下的雏鹅，该病可持续7~10 d，发病率和死亡率高，致死率为50%~80%。受感染的小鹅出现痛风、厌食、精神沉郁、拉白色粪便，嗜睡，部分小鹅眼睑变灰色、混浊，生长也会受到抑制。解剖发现胆囊、肾脏、心脏、肝脏、气管等器官和关节出现尿酸盐沉积；肾脏的损伤最为严重，出现出血和肿胀[19]。组织病理学分析显示肾小管上皮细胞坏死、脱落，炎症细胞浸润肾脏组织中，肝细胞空泡变性伴炎症，脾淋巴细胞浸润、解体、坏死，小胶质细胞增殖，在大脑皮层中，死亡的神经细胞被小胶质细胞包裹。痛风病的鹅盲肠绒毛明显缩短，抑制了肠粘膜屏障的功能。此外，在死亡的雏鹅中观察到脑炎病变。发病存活下来的鹅生长缓慢，容易受到细菌感染[20]。

3 发病机理

鹅星状病毒在鹅身体的多个组织中复制，包括心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、法氏囊、胸腺、胰腺、脑、腺胃和肠。病毒在肾脏的出现率最高，其次是脾脏和肝脏[21]。苏木精染色显示，脾切片中脾细胞出血和坏死；肾切片间质出血，肾小管坏死和肾小球肿胀，尿酸结晶；肝切片的肝细胞变性。GoAstV感染早期可激活宿主免疫反应，TLR3、RIG-I和MDA5参与了GoAstV的宿主免疫应答，感染过程中IFN I型(IFN-α、IFN-β)、炎症因子(IL-8、IL-10、TNF-α)、抗病毒蛋白(Mx、OASL、PKR)和MHC-I的表达也上调。相比之下，促炎细胞因子(IL-1β，IL-6)和MHC-II的表达被抑制。然而，快速的病毒复制、抑制炎症因子(IL-1β，IL-6)和MHC-II的表达可能是宿主免疫反应不能提供足够的保护来对抗GoAstV感染的原因[20]。研究指出，GoAstV感染可引起肾上皮细胞自噬，刷状缘和细胞间连接破坏，足细胞损伤，纤维化增加，最终导致肾脏损伤[22]。Moser等人[23]研究表明，星状病毒可以增加上皮细胞的通透性。星状病毒诱导的肾上皮细胞通透性增加可能导致痛风病。此外，由于家禽缺乏精氨酸酶，氨不能代替嘌呤，次黄嘌呤和黄嘌呤加工成尿素，然后氧化成尿酸，形成尿酸钠和尿酸钙，最后通过肾脏排泄。如果尿酸盐形成的速率大于泌尿器官的排泄能力，则内脏表面上的尿酸盐沉积物可引起痛风[24]。因此，引起肾脏和尿路损伤或尿液浓度和尿排泄紊乱的因素可以促进尿酸盐沉积物的形成。鹅星状病毒可引起肾脏损害，这可能是引起小鹅痛风的主要原因。

4 流行现状

2016年11月，鹅星状病毒在山东被发现，并迅速蔓延到我国的其他主要产鹅省份[25]，江苏、河南、河北、安徽、湖北、广东、湖南、辽宁、福建、浙江、四川、内蒙古、黑龙江、海南等省均有GoAstV感染检测阳性的报告。不同的省份感染率和死亡率有一定差异。ZHU Q H等[26]在黑龙江省鹅场检测出GoAstV-2型鹅星状病毒。与GoAstV原株相比，菌株HLJ2021的刺突结构域540Q氨基酸位点发生了影响蛋白结构的突变。菌株HLJ2021与AstV/HB01/Goose/0123/19发生重组，产生重组菌株。HLJ2021菌株对小鹅也表现出较强的致病性。感染死亡率为83.3%。FU X L等[18]对广东省和福建省的GoAstV基因组进行进化分析，结果表明GoAstV在中国南方鹅体内广泛存在，且GoAstV-1和GoAstV-2在鹅体内循环。

5 诊断检测技术

ORF2开放阅读框的5’端基因序列属于保守基因序列，该特征为研制Cap蛋白抗体和以Cap保守区域为基础设计引物和探针奠定了理论基础。

5.1 反转录环介导等温扩增反应（RT-LAMP）检测

在病毒学诊断技术的研究进展中，环介导等温扩增（LAMP）技术可以在短时间内扩增核酸，已用于快速检测各种病毒，包括禽星状病毒[27]。LAMP检测用一套4个特异性引物可以识别6个不同的序列，是一种成本低、省时、高特异性和灵敏性的方法[28]。根据ORF1b基因的保守区设计并筛选出两组引物，最终确定采用一引物组在水浴锅中完成RT-LAMP的检测，反应的最佳温度和时间分别为61 ℃和30 min，利用琼脂糖凝胶电泳和染料指示剂显色对RT-LAMP结果进行评估。RT-LAMP法检测GoAstV分别基于琼脂糖凝胶电泳结果和肉眼检测颜色变化所判定的灵敏度，与荧光定量法灵敏度相同。RT-LAMP方法所用引物组可特异性地检测GoAstV，并未与其它常见的禽类病原体发生交叉反应。

5.2 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测

RT-PCR方法也可以用来检测鹅星状病毒，基本原理是提取阳性GAstV病料的RNA并进行反转录，以反转录获得的cDNA为模板进行PCR扩增[29，30]。

RT-PCR扩增反转录体系为：2 uL引物、4 uL 5×反转录缓冲液，2 uL二硫酸糖醇（DTT）、7 uL RNA模板、4 uL dNTP Mix（10 mM）。42 ℃反应50 min，82 ℃反应5 min，得到cDNA。

以cDNA为模板进行PCR扩增的反应体系为：2 uL 引物、6 uL 双氧水、2 uL cDNA、10 uL Mix酶，95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，退火40 s，72 ℃延伸60 s，35个循环，72 ℃延伸 10 min。之后将获得的PCR产物加入1%凝胶中进行电泳并进行紫外分析[31，32]。根据GAstV-1和GAstV-2差异最大的ORF2的基因序列设计两对引物，可以在FAM和VIC通道中分别获得gstv -1和gstv-2的荧光信号，gstv -1和gstv -2的检出限分别为33.3、33.7倍/μL 。RT-PCR方法具有较高的特异性、敏感性和重复性，可用于临床对GAstV-1和GAstV-2的检测[33]。

5.3 双重定量PCR（qPCR）检测

YANG K K等结合鹅细小病毒(GPV)和鹅星状病毒(GAstV)的保守基因组区设计两对引物，使用双重定量PCR (qPCR)方法同时检测这两种病毒。根据GPV(变性温度82.1 ℃)和GAstV(变性温度79.8 ℃)不同来区分它们。与其它水禽病毒混合试验没有产生交叉反应。 GPV和GAstV的检出限分别为5.74 × 101倍/μL和6.58 × 101倍/μL。研究表明该方法具有较高的灵敏度、特异性和重复性，可用于流行病学研究，能有效控制GPV和GAstV的传播[34]。

5.4 定量环介导等温反应扩增（qLAMP）检测

定量环介导等温反应扩增（qLAMP）方法检测鹅星状病毒简便、灵敏、快捷。一组4个特异性引物，包括2个内引物和2个外引物，以鹅星状病毒的ORF1a基因作为靶向基因进行PCR扩增，之后用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测。鹅星状病毒qLAMP扩增的最优条件为：25 uL LAMP反应体系中加入2个内引物（各1 uL）、2个外引物（各1 uL）、2.5 uL 10×等温扩增缓冲液，1 uL Bst DNA聚合酶（8 U/uL）、2 uL DNA模板、11.25 uL无核酸酶水、3.5 uL dNTP Mix（10 mM）、1.5 uL MgSO4(100 mM)，扩增温度为65 ℃恒温水浴，反应时间60 min。qLAMP检测方法特异性强，稳定性好，与其它病毒无交叉反应，对鹅星状病毒检出最低限为1×101倍/uL，与传统PCR的检出最低限1×104倍/uL相比，灵敏度要高许多[35]。

5.5 免疫学诊断方法

使用抗体的免疫学诊断方法是筛选和分析病毒抗原的较好方法。单克隆抗体（mAb）被广泛应用于免疫学诊断。鹅星状病毒纤突蛋白（VP27蛋白）是一种重要的衣壳蛋白，是开发诊断试剂的候选蛋白，可以诱导宿主产生中和抗体。

5.5.1 Cap蛋白单克隆抗体的制备[36，37]通过克隆VP27基因来制备特异性单克隆抗体（mAb），经蛋白质印记分析和免疫荧光分析表明，该单克隆抗体可特异性识别感染细胞中的VP27，具有较高的诊断潜力。

制备抗原：以Cap保守区域为基础设计引物，并以cDNA为模板进行基因扩增，回收目的基因片段，并将该目的基因与大肠杆菌表达载体（pET-30a）进行酶切反应以获得阳性重组表达质粒pET-30a-Cap，并将其接种到LB培养基中培养，并加入1 mmol/L的诱导剂ITPG（异丙基硫代半乳糖苷，Isopropyl β-D-Thiogalactoside）诱导5 h，采用尿素法进行变性复性，并利用镍柱系统进行蛋白纯化。采用Western blot方法对获得的重组蛋白进行纯度鉴定，在目的位点出现特异性条带则可作为免疫原免疫实验动物制备单克隆抗体。

动物免疫与细胞融合：将纯化、鉴定后的重组蛋白乳化后，皮下注射实验动物（一般为BLAB/C实验小鼠），经过三次免疫，取免疫后的小鼠脾脏制备细胞悬液，与对数期生长的骨髓瘤细胞进行细胞融合。

杂交瘤的筛选及抗体性质检测：通过HAT选择培养基（H-Hypoxanthine次黄嘌呤，A-Aminopterin氨基蝶呤，T--Thymidine 胸腺嘧啶核苷）或者ELISA的方法筛选出呈阳性的杂交瘤细胞。之后检测阳性杂交瘤细胞的抗体性质，包括特异性、中和活性、亲和力、亚类、识别抗原表位等的检测与鉴定。

杂交瘤的克隆化：选取抗体性质优良的杂交瘤细胞，采用有限稀释法或软琼脂平板法进行克隆纯化，制备腹水。

5.5.2 Cap蛋白多克隆抗体的制备 吕炫等[38]通过大肠杆菌系统表达纯化GAstV-2 Cap蛋白，制备了具有较高效价的多克隆抗体。刘莉等[39]采用同样的方法制备了GAstV-1Cap蛋白的多克隆抗体。

与多克隆抗体相比，单克隆抗体性质更稳定，对抗原的特异性更强。蛋白抗体的制备技术可为鹅星状病毒感染的临床诊断及检测方法的建立奠定理论基础。

6 防控技术

6.1 鹅星状病毒感染的预防

6.1.1 注射有效疫苗和抗体 疫苗接种是预防病毒的重要措施。Sellers 等[40]研究表明通过用杆状病毒表达系统表达的鸡星状病毒衣壳蛋白接种种鸡，能够刺激机体产生抗体，而且可以通过卵黄将抗体传递至后代维鸡。目前，还没有商业化的疫苗或其它方法来预防鹅星状病毒。孙永林[31]用制备的卵黄抗体对1日龄雏鹅进行颈部皮下注射免疫（免疫剂量为1 mL），免疫过的雏鹅精神状态良好，未出现尿酸盐沉积、痛风等临床症状，这表明卵黄抗体对鹅星状病毒有较好的预防效果。D. Xu等[41]通过在重组的GAstV蛋白中插入鹅源新城疫（NDV）弱毒株制备二价疫苗，对GAstV和NDV感染均具有一定保护作用，但由于各种GAstV亚型之间混合感染，使用其它病毒作为疫苗载体需要进一步研究。荣雪路等[42]制备了鹅星状病毒重组衣壳蛋白亚单位疫苗，并在开产前5周对种鹅进行胸部肌肉注射（1 mL/羽），28 d后对种鹅进行免疫效力测定，抗体效价不低于3.6 log2，产蛋卵黄中抗体效价不低于3.01 log2，孵出的雏鹅血清中抗体效价不低于2.7 log2，免疫效果良好。姚伦广等[43]研制了鹅星状病毒灭活疫苗，并进行攻毒试验，可实现100%保护。张立武[44]等研究发现，卵黄抗体虽可预防鹅星状病毒，但预防保护期短，需要重复注射来控制严重疫情。灭活疫苗的缺点是至少有7 d的免疫空白期，而鹅易在免疫空白期内感染而发病。针对卵黄抗体和灭活疫苗的不足，用SD毒株作为灭活抗原，经过两次乳化制备的一种卵黄抗体复合物，一方面可以有效预防鹅星状病毒，另一方面预防保护期较长，可以对鹅的整个生长周期进行保护。王桂军等[45]采用薄膜扩散法制备脂质体作为疫苗佐剂把VP27蛋白包裹起来，起到缓释抗原的作用，可以延长抗原蛋白在机体内的时间，使受免疫动物可持续产生中和抗体，从而进一步延长免疫保护期。

6.1.2 切断传播途径 环境控制：合理选择鹅场地址，场地布局和设施设备要科学，从无疫区的标准化种禽场引种，并做好引种检疫，有效切断传播途径。加强饲养管理：合理安排饲养密度，配置营养合理的饲料，减少应激；实行全进全出饲养，空场或空舍2周以上方可饲养下一批雏鹅。严格执行消毒程序：做好空舍消毒、带鹅消毒、用具消毒、人员车辆消毒等；鹅群清空后，对非易燃的笼具、地面进行火焰消毒；另外，在中午选用0.2%~0.3%的过氧乙酸带鹅喷雾消毒[46，47]。做好无害化处理：对病死鹅、垫料、粪便等进行无害化处理，防止疫病传播。

6.2 鹅星状病毒感染的治疗

饮水中添加护肾利尿的药物和葡萄糖可促进尿酸排出，缓解痛风症状。孙永林[32]对雏鹅开展攻毒治疗试验，研究表明分别在1日龄和7日龄注射两次卵黄抗体，可有效治疗雏鹅痛风。张凌云等[48]用鹅星状病毒亚单位疫苗免疫之后制备的卵黄抗体连续10 d注射患病鹅，死亡率可降至5.4%~6.4%，研究表明卵黄抗体可有效治疗鹅星状病毒感染。李海利等[49]研发一种中药制剂（黄芪40份、石韦20份、栀子16份、金银花12份、蟑螂10份、黄芩6份、茵陈蒿6份、苦参3份、萹蓄2份），肌肉注射患病鹅（4 mL只，2次/d），可显著降低尿酸盐浓度，有效控制病情。

7 结论与展望

鹅星状病毒是危害我国鹅产业发展的一种新型病毒，疫苗的研制与应用仍然是鹅星状病毒研究的重点。制备具有较好防控效果的疫苗需要不断模仿病毒感染的过程，不断了解鹅星状病毒传播的特点和感染机制才可以从根本上解决鹅星状病毒感染所导致的鹅痛风问题。未来的研究可以从鹅星状病毒跨宿主传播的致病性、鹅星状病毒的致病机制、鹅星状病毒治疗药物的研发等方面开展。