闪式提取法提取油茶果壳中单宁的工艺研究

张余华，吴 艳，黄建军，贺义昌★，王召滢，雷小林

（1.井冈山市林业局，江西 井冈山 343600；2.峡江县林业局，江西 吉安 331400；3.江西省林业科学院，江西 南昌 330013）

油茶（Camellia oleifera）又称茶子树、茶油树、木子树，为山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）常绿小乔木。是我国特有的高级木本油料植物，广泛分布于淮河以南等地[1]，种子榨油供人食用。茶油色香味清，营养丰富，易储藏，含有许多的不饱和脂肪酸，以及多种抗氧化活性成分，是一种健康食用植物油，长期食用能够保护人体心血管功能、提高免疫力、预防高血压疾病等[2-7]，同时其也可作为润滑油、防锈油以做工业用途。油茶果壳占油茶果总质量的60%以上[8]，其主要成分有纤维素、半纤维素和植物单宁，它们都是化工、肥料、食品、饲料工业产品等的原料，油茶果壳还能用来制成糖醛、活性炭等物质[9]。调查发现，大部分企业和农户加工茶油后剩下的油茶果壳通常都会被填埋或者焚烧，不仅导致生物活性化合物的浪费，还造成环境污染，目前仅有宜春一家企业利用油茶果壳作为基质生产海鲜菇，大量的油茶果壳尚待开发利用。因此，通过一定的工艺手段将废弃的油茶果壳中的活性成分提取出来变废为宝，不但可以获得较大的经济收益，助力乡村振兴，还可以很大程度改善生态环境。油茶果壳中单宁含量高，是丰富的天然鞣质来源。单宁又称作单宁酸，是一种有着生物活性的高分子多元酚类化合物，与蛋白质生物碱多糖具有结合能力，易与金属离子发生络合反应，可溶于水和极性有机溶剂；具有良好的抗菌、抗病毒、抗过敏、抗氧化等生理活性[10]，广泛应用于皮革生产、食品、日用化工等行业，也可以作为化妆品的成分，起到收敛、防晒、美白、抗皱、保湿及防腐作用[11-13]。提取油茶果壳中单宁的方法有很多，如浸提法、超声波提取法[14]、微波提取法[15]等，目前为止，关于闪式提取法提取油茶果壳中单宁的研究鲜有报道。闪式提取法是一种用于植物软、硬组织破碎的新型提取方法，它是依靠高速机械剪切力和超动分子渗滤技术，在溶剂存在下短时间内把植物破碎至细微颗粒，并使有效成分迅速达到组织内外平衡，通过过滤达到提取目的。闪式提取法能最大限度保留植物的有效成分，且其成分受热不易破坏，提取时间短，溶剂用量小，且结构紧凑，使用时安全可靠[16]。本研究以油茶果壳为材料，通过单因素和正交试验筛选出闪式提取法提取油茶果壳中单宁的最优工艺条件，并且还对收集自不同地区的不同品系油茶果壳单宁含量进行差异性分析，以期为后续研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在江西省内，收集了6个赣无系列的不同油茶品系，分别是赣无1、赣无2、赣8、赣68、赣70、兴48，其中赣无1采自信丰、靖安；赣无2取自高安、信丰、靖安、宜春、丰城；赣8取自高安、靖安、宜春、山茶园、林丰林场；赣68取自信丰、林丰林场、马13号2小区、马18号3小区；赣70取自宜春、林丰林场；兴48取自丰城、宜春、山茶园、林丰林场。试验使用的油茶果壳样品经过晒干、除去灰土、碎石和碎屑等步骤之后，用粉碎机粉碎后过筛，备用。

1.2 仪器与试剂

ME104E电子天平（美国梅特勒）；XHF-DY闪式提取器（宁波新芝）；UV-1800紫外可见分光光度计（日本岛津）；DW-HL430粉碎机（中科美菱）；RE52-86A旋转蒸发仪（上海亚荣）。

单宁酸，二甲基甲酰胺，柠檬酸铁铵，钨酸钠，钼酸钠，碳酸钠，甲醇、无水乙醇均为分析纯；水为超纯水。

1.3 实验方法

1.3.1 单宁的提取方法

称取0.3 g油茶果壳粉末，加入1 mL的蒸馏水，充分摇匀成匀浆后转移到EP管中，闪式提取，离心10 min，取上清液待测。

1.3.2 单宁的测定方法

单宁在碱性条件下与磷钼酸反应，生成蓝色化合物，在760 nm处有最大吸收峰。波长调节至760 nm处，用蒸馏水调零；试剂一（钨酸钠-钼酸钠混合溶液）和试剂二（碳酸钠溶液）37℃预热10 min以上。

取两支试管标记为对照管和测定管，在对照管中加入135μL蒸馏水，测定管中加入5μL样本和130 μL蒸馏水，混匀后两支试管分别加入35μL试剂一，摇匀静置5 min，分别加入30μL试剂二，混匀，室温静置30 min，760 nm处读取吸光值A，△A=A测定-A对照。

1.3.3 单宁含量计算

用微量石英比色皿测定的公式如下：

标准条件下测定的回归方程为：y=1.6418x+0.0134；x为标准品质量浓度（mg·mL-1），y为△A（其值为A测定-A对照）。

单宁含量（mg·g-1）=[(ΔA-0.0134)÷1.6418×V1]÷(W×V1÷V2)=0.609×(ΔA-0.0134)÷W

V1为加入样本体积，mL；V2为加入提取液体积，mL；W为样本质量，g。

1.3.4 单因素试验和正交试验

在上述实验操作方法上，选取闪式提取时间（1 min、2 min、3 min、4 min、5 min）、乙醇体积分数（30%、40%、50%、60%、70%）、料液比（g∶mL）1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16作为影响因素，以单宁含量作为测定指标进行单因素试验；通过单因素试验结果选取最佳影响因素进行正交试验，测定单宁含量，得到闪式提取油茶果壳单宁的最优工艺条件。

1.3.5 数据处理

使用Excel进行数据的整理与计算；利用DPS数据处理系统进行差异性分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 提取时间对油茶果壳中单宁含量的影响

称取油茶果壳样品0.3 g，按乙醇体积分数50%，料液比（g∶mL）1∶10，转速15 000 r·min-1,在提取时间分别为1 min、2 min、3 min、4 min、5 min的条件下提取，按照1.3项下的实验方法进行操作。由图1可知，当提取时间＜3 min时，单宁含量随提取时间的增加而增加，当提取时间＞3 min后，果壳中单宁含量反而逐渐下降，原因可能是提取时间越长，温度升高导致分子结构被破坏，生物活性下降，导致单宁含量降低。故后续实验的提取时间确定为3 min。

图1 提取时间对单宁含量的影响Fig.1 Effect of extraction time on tannin content

2.1.2 乙醇体积分数对单宁含量的影响

称取油茶果壳样品0.3 g，按提取时间3 min，料液比（g∶mL）1∶10，转速15 000 r·min-1，在乙醇体积分数分别为30%、40%、50%、60%、70%的条件下提取，按照1.3项下的实验方法操作。由图2可知，当乙醇体积分数低于60%时，油茶果壳中单宁的含量随乙醇体积分数的增加而上升，当乙醇体积分数高于60%时，油茶果壳中单宁含量随乙醇体积分数的增加而下降，原因可能是油茶中的其他醇溶性物质随着体积分数的增加而溶解，与单宁竞争乙醇导致单宁含量降低。因此，本文后续实验的乙醇体积分数确定为60%。

图2 乙醇体积分数对单宁含量的影响Fig.2 Effects of ethanol on tannin content

2.1.3 料液比对单宁提取的影响

图3 料液比对单宁含量的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on tannin content

称取油茶果壳样品0.3 g，按乙醇体积分数为60%，转速15 000 r·min-1，提取时间3 min，在料液比（g∶mL）分别为1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16的条件下提取，按照1.3项下的实验方法操作。由图3可知，当料液比低于1∶12时，油茶果壳中单宁含量随料液比的增加而增大，当液料比高于1∶12时，单宁含量出现小幅度的减少。这可能是由于一开始油茶果壳中的单宁没有被提取完全，当溶剂的用量增加时，增大了其与提取溶剂的接触面积，固液浓度差拉大，有利于扩散速度的提高，所以提取量不断增加。因此在后续的实验中将使用1∶12的料液比进行实验。

2.2 正交试验

在单因素试验的基础上，为了进一步考察各因素对油茶果壳中单宁含量的影响，得出闪式提取法提取油茶果壳中单宁的最佳工艺条件，本文选择提取时间（2 min、3 min、4 min）、乙醇体积分数（50%、60%、70%）、料液比（g∶mL）1∶10、1∶12、1∶14为主要影响因素，进行3因素3水平的正交试验，采用L9(33)正交表探究提取时间、乙醇体积分数、料液比对油茶果壳中单宁的提取量的影响程度大小及闪式提取法最佳的工艺条件，结果见表1、表2。

表1 提取条件因素水平Tab.1 Extraction condition factor level

表2 L9(33)正交试验表及极差分析结果Tab.2 L 9(33)Orthogonal test design table and range analysis results

正交试验和极差分析结果如表2所示，分析可知，本实验影响因素排序为：提取时间＞料液比＞乙醇的体积分数。根据单宁含量进行分析，最佳组合为A2B2C1，即提取时间为3 min，乙醇体积分数为60%，料液比为1∶10，所得单宁含量为0.039 mg·g-1。

2.3 验证性实验

精确称取油茶果壳样品0.3 g，在最佳工艺A2B2C1（提取时间3 min，乙醇体积分数为60%，料液比1∶10）的条件下，按1.3中的实验方法进行操作，测定吸光度，并且计算出油茶果壳中单宁含量。进行3次平行验证性实验，得到的验证结果为0.039 mg·g-1，说明该实验条件下筛选的最佳提取工艺稳定性较好，可行性较高。

2.4 不同品系油茶果壳单宁含量的差异性分析

将不同品系的油茶果壳采用1.3中的实验方法测定其单宁的含量，并对结果采用DPS软件进行统计分析，结果如表3所示。

表3 不同品系油茶果壳的单宁含量比较Tab.3 Comparison of tannin content in different strains of C.oleifera shell

采集的6个品系油茶果壳单宁含量在0.031～0.04mg·g-1范围，其中赣70的平均单宁含量最高，为0.039 mg·g-1，其次是赣无2，为0.035 mg·g-1，赣8和兴48的单宁含量相近，含量最低的是赣无1和赣68，为0.031 mg·g-1。结果表明6个品系油茶果壳单宁含量差异不明显，在不同地区采集的同一品系油茶果壳其单宁含量差异不明显，原因可能是油茶果壳单宁是油茶果壳次生代谢产物，基本不受不同品系和不同地理因子的影响。

3 结论与讨论

本文以油茶果壳为材料，通过单因素试验确定了闪式提取法提取时间、乙醇体积分数、料液比对单宁含量的影响，通过正交试验对闪式提取法提取油茶果壳中的单宁工艺进行了优化，得出了最佳的工艺条件，即闪式提取时间为3 min，乙醇的体积分数为60%，料液比为1∶10。该条件下提取时间短、效率高、所得单宁含量高。同时对收集到的江西省林业科学院选育出的6个不同无性系的油茶果壳单宁含量进行测定，结果表明，不同无性系的油茶果壳的单宁含量无显著差异。

闪式提取法是近年来出现的一种新型提取方法，与传统提取方法相比较，闪式提取法具有提取时间短、提取效率高、操作简便、节能高效且所提取单宁含量也有一定的提高等优点，此方法已被用于黄酮、党参炔苷、植物单宁、香菇多糖等生物活性成分的提取，目前鲜有人用此法来提取油茶果壳中的单宁，本文通过实验证实了用闪式提取法提取油茶果壳中的单宁这一方法是可行的，并得出了最优工艺条件，为后续纯化单宁等研究提供参考和实验基础，对今后油茶果壳生物活性成分提取的规模化应用具有良好影响。

油茶在我国种植面积大、范围广、来源易，其早期研究主要以种子和根茎为主。油茶籽可取出榨油，而油茶果壳常常被视为废弃物，其实油茶果壳不仅可以用来作生产助剂和表面活性剂的原料，也可以直接磺化，制成磺化油用于丝绸工业，皂化后用于制皂业和印染工业等。油茶果壳所含活性成分较多，有多糖、黄酮、皂苷、多酚、单宁等，其中单宁具有抗菌、抗病毒、抗过敏等作用，从油茶果壳中提取的天然色素也广泛运用于食品、医药、化妆品等行业，提取出来的活性成分和天然色素在食品、营养补充剂和化妆品添加剂等领域具有良好的前景。对油茶各个部分进行充分研究不仅可以减少资源的浪费，而且可以推动研究技术的发展。国家林业和草原局《林草产业发展规划（2021-2025年）》中提及茶油年产量从72万t提升到200万t，可见国家对油茶产业的重视程度。江西省也重点支持油茶产业高质量发展，发展油茶产业大有可为。