水杉叶浸提液对银杏苗生理生化的化感效应

李广云 曹永富 刘瑞倩 郁万文

摘要：  以水杉叶水浸提液为供体，银杏幼苗为受体，研究银杏幼苗对水杉叶浸提液添加的生理响应，结果表明：（1）银杏叶中可溶性糖和可溶性蛋白含量在低浓度水杉叶浸提液处理中低于对照，但随着添加浓度的升高而升高;银杏叶中游离脯氨酸、总黄酮含量及黄酮清除DPPH自由基能力随着浓度的升高呈“升高-降低”的变化趋势，其中T2处理的3个指标最高。（2）可溶性糖含量与可溶性蛋白含量、游离脯氨酸及总黄酮含量存在中等强度的负相关，其中与游离脯氨酸含量存在显著性相关;可溶性蛋白含量与游离脯氨酸含量存在极显著的高强度正相关，游离脯氨酸含量与总黄酮含量存在中等强度的正相关，总黄酮与其清除DPPH自由基能力存在弱度的正相关。（3）基于隶属函数评价，第一次采样时的处理排名为T2>T4>CK>    T1>T3，第二次采样时的处理排名为T2>T3>T4>T1>CK，两次采样均是以T2较优。综上所述，水杉叶浸提液对银杏幼苗具有一定的化感作用，表现为中高浓度下促进，低浓度下抑制。

关键词：  化感作用; 水浸提液; 水杉; 银杏; 生理生化

中图分类号：   S 792. 95               文献标识码：   A                文章编号：1001 - 9499（2022）01 - 0017 - 04

化感作用是植物种间相互作用的重要途径，对群落的植物组成、分布及其演替过程具有重要作用，是影响森林天然更新的重要因子。混交林的营造也要充分考虑化感作用的影响。以植物化感作用原理为指导，充分发挥其相生作用、互补作用，从而实现中药材的高产、优质、安全、高效。本文以水杉叶水浸提液为供体，银杏幼苗为受体，研究银杏幼苗对水杉叶浸提液添加的生理响应，为实现水杉及银杏种植产业中的复合经营系统提供依据。

1 试验材料

1. 1 种子处理

2019年10月上旬采集郯城银杏种质资源圃中银杏优良单株上的种实，去外种皮后清洗干净，并进行湿藏层积处理45天，完成生理成熟后，将种子于27 ℃用湿布覆盖催芽，种子露白播入口径10 cm、高20 cm的营养钵中，每盆2粒，每天光照16 h，温度27.5 ℃，光照强度为2 500 lx;暗处理8 h，温度25.0 ℃。

1. 2 水杉叶浸提液的制备

称取80g水杉凋落叶粉末，置于1 L烧杯中，加入800 mL蒸馏水，待叶粉完全浸湿后，超声30 min，继续24 h。用4层灭菌医用纱布过滤，得到浓度为100 mg/mL的水杉凋落叶浸提液。用去离子水将母液分别配置成12.5、25、50和100 mg/mL的处理液，记作T1、T2、T3、T4;以去离子水作对照（CK），置于4 ℃冰箱待用。

2 试验方法

2. 1 试验设计

于2020年4月26日，选取长势一致的银杏幼苗，按CK、T1、T2、T3、T4 设置5个处理，每个处理6盆，一次性浇入相应浓度浸提液100 mL，以后每3天补水一次，保持基质湿润。分别于处理后的第5天、第10天采集银杏叶片，进行生理生化指标的测定。

2. 2 測定项目与方法

可溶性糖含量的测定 取相同部位的叶片0.1 g，采用蒽酮法测定可溶性糖含量;首先配置试剂，将76 mL的浓硫酸加入到30 mL的去离子水中稀释待完全冷却至室温后，向溶液中加入100 mg的蒽酮，搅拌至完全溶解，待用。将切取的叶片分别放入标记好的10个10 mL移液管中，并加入8 mL去离子水，再将其放入沸水中30 min后取出。待完全冷却至室温后，吸取样品提取液0.1 mL于新的10 mL移液管中，并向提取液中加入3 mL的蒽酮-浓硫酸试剂，再将其放入100 ℃的水浴锅中水浴30 min，每个浓度梯度3次重复（另做两个空白组用作参比）。待其冷却至室温后，以空白做参比，在630 nm波长下测用不同浓度浇灌的银杏叶片的吸光值。

可溶性蛋白含量的测定 取相同部位的叶片0.1 g，采用考马斯亮蓝染色法测定可溶性蛋白质含量;首先配置试剂，称取100 mg的考马斯亮蓝G-

250粉末，溶解于50 mL的无水乙醇中，加入100 mL 85%的磷酸，用水定容至1 000 mL，此药品试剂常温下可保存30天。将切取并研磨好的叶片粉末分别放入标记好的10个10 mL移液管中，并加入8 mL去离子水，再将其放入沸水中30 min后取出。待完全冷却至室温后，吸取样品提取液1 mL于新的10 mL移液管中，并向提取液中加入3 mL的考马斯亮蓝G-250试剂（另做两个空白组用作参比）。晃匀后，以空白做参比，在590 nm波长下测定不同浓度水杉叶浸提液浇灌的银杏叶片的吸光值。

脯氨酸含量的测定 另取0.1 g 叶片采用茚三酮法测定脯氨酸含量。首先配置试剂，称取6 g的磺基水杨酸，用去离子水定容至200 mL。再称取2.5 g茚三酮，加入60 mL的冰醋酸以及40 mL 6 mol/L的磷酸加热溶解，冷却后储藏于棕色试剂瓶内。将切取的叶片分别放入标记好的10个10 mL移液管中，并加入1 mL磺基水杨酸，再将其放入沸水中10 min后取出。待完全冷却至室温后，吸取样品提取液1 mL于新的10 mL移液管中，并向提取液中先后加入1 mL的冰乙酸和1.5 mL的茚三酮显色液，再将其放入100 ℃的水浴锅中水浴40 min，每个浓度梯度做3组重复（另做两个空白组用作参比）。待其冷却至室温后，以空白做参比，在520 nm波长下测用不同浓度浇灌的银杏叶片的吸光值。

总黄酮含量的测定 将采样后剩余的银杏叶片烘干，研磨成粉末称量并记录质量，再将其分别倒入事先标记好的10个10 mL的移液管中并先后加入事先配好的30%乙醇5 mL和5%NaNO2，5 min后加入10%Al（NO3）30.35 mL，6 min后加入10%NaOH 2.5 mL，混匀，再用30%乙醇定容至10 mL后放入40 ℃的水浴锅中水浴10 min，每个浓度梯度做3组重复（另做两个空白组用作参比）。拿出待冷却后，以空白做参比，在510 nm波长下测用不同浓度浇灌的银杏叶片的吸光值。

数据处理方法 采用DPS7.04和Excel 2016统计分析软件对试验数据进行处理和方差分析，运用Turky法进行多重比较。

3 结果与分析

3. 1 水杉叶浸提液对银杏叶中可溶性糖含量的影响

随着水杉叶浸提液质量浓度的提高，银杏幼苗叶中可溶性糖总体呈现升高的趋势（图1），但各浓度间差异不显著（p>0.05），且在低浓度时低于CK;随着处理时间的延长呈下降的趋势，但差异不显著（p=0.0545）。

图1 浸提液对银杏叶可溶性糖含量的影响

3. 2 水杉叶浸提液对银杏叶中可溶性蛋白含量的影响

随着水杉叶浸提液质量浓度的提高，银杏幼苗叶中可溶性蛋白总体呈现升高的趋势（图2），但各浓度间差异不显著（p=0.086 3），且在低浓度时低于CK;随着处理时间的延长呈升高的趋势，但差异显著（p=  0.015 5）。

3. 3 水杉叶浸提液对银杏叶中游离脯氨酸含量的影响

随着水杉叶浸提液质量浓度的提高，银杏幼苗叶中游离脯氨酸含量呈升高-降低的变化趋势（图3），且各浓度间差异显著（p=0.0326），在T2处理达到最大值;随着处理时间的延长呈升高的趋势，但差异极显著（p=0.003 2）。

3. 4 水杉叶浸提液对银杏叶中总黄酮含量的影响

随着水杉叶浸提液质量浓度的提高，银杏幼苗叶中总黄酮含量呈现升高-降低的变化趋势（图4），且各浓度间差异显著（p=0.1740），在T2处理达到最大值并显著高于对照;随着处理时间的延长呈升高的趋势，但差异不显著（p=0.6267）。

3. 5 水杉叶浸提液对银杏叶总黄酮清除DPPH·自由基能力的影响

随着水杉叶浸提液质量浓度的提高，银杏幼苗叶总黄酮清除DPPH·自由基能力总体呈现升高-降低的变化趋势（图5），且各浓度间差异不显著（p=  0.550），在T2处理达到最大值;随着处理时间的延长呈降低的趋势，但差异不显著（p=0.9283）。

3. 6 相关性分析

可溶性糖含量与可溶性蛋白含量、游离脯氨酸及总黄酮含量存在中等强度的负相关，其中与游离脯氨酸含量存在显著性相关。可溶性蛋白含量与游离脯氨酸含量存在极显著的高强度正相关，游离脯氨酸含量与总黄酮含量存在中等强度的正相关，总黄酮与其清除DPPH自由基能力存在弱度的正相关（表1）。

3. 7 隶属函数评价

由不同水杉叶浸提液及采样时间处理的隶属函数值及排名（表2）可知：两次采样时间的不同浓度浸提液处理，第一次采样时的处理排名为T2>T4>  CK>T1>T3，第二次采样时的处理排名为T2>T3>T4>  T1>CK，其中兩次采样均是以T2较优，且随着处理时间的延长，添加水杉浸提液有利于上述生理代谢。

4 结论与讨论

4. 1 银杏叶中可溶性糖和可溶性蛋白含量在低浓度水杉叶浸提液处理中低于对照，但随着添加浓度的升高而升高。银杏叶中游离脯氨酸、总黄酮含量及黄酮清除DPPH自由基能力随着浓度的升高呈升高-降低的变化趋势，其中T2水平时升至最高点。相关性分析表明，可溶性糖含量与可溶性蛋白含量、游离脯氨酸及总黄酮含量存在中等强度的负相关，其中与游离脯氨酸含量存在显著性相关。可溶性蛋白含量与游离脯氨酸含量存在极显著的高强度正相关，游离脯氨酸含量与总黄酮含量存在中等强度的正相关，总黄酮与其清除DPPH自由基能力存在弱度的正相关。上述分析表明，水杉叶浸提液的添加，促使更多的碳水化合物（如可溶性糖）转化成含氮化合物（如可溶性蛋白及游离脯氨酸等），进一步促进了黄酮类化合物的合成与积累。基于隶属函数评价，两次采样时间的不同浓度浸提液处理，第1次采样时的处理排名为T2>  T4>CK>T1>T3，第2次采样时的处理排名为T2>   T3>T4>T1>CK，其中两次采样均是以T2较优，且随着处理时间的延长，添加水杉浸提液有利于上述生理代谢。

4. 2 水杉叶浸提液对银杏幼苗具有一定的化感作用，表现为中高浓度下促进，低浓度下抑制。在自然界中，通过雨水淋洗进入土壤的浸提物是少而慢的，其作用应该类似与本实验的低浓度处理。同时本研究的时间较短，测定指标侧重生理指标，今后应延长研究周期及加大生长指标的测定来完善相关的研究。

参考文献

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第1作者简介：  李广云（1980-），女，高级工程师，主要从事林业科研科技推广、森林病虫害防治等研究。

收稿日期： 2021 - 12 -  01

（责任编辑：   李 丹）

Allelopathic Effects of Extracts from Metasequoia Metasequoia Leaves

on the Physiology and Biochemistry of Ginkgo Biloba Seedlings

LI Guangyun

（Linyi Forest Wetland Protection Center，  Shandong Linyi 276000）

Abstract The water extract of metasequoia metasequoia leaves was used as the donor and ginkgo biloba seedlings as the acceptor to study the physiological response of ginkgo biloba seedlings to the extract of metasequoia metasequoia leaves， so as to provide a basis for the construction of metasequoia metasequoia and ginkgo biloba compound management system. The main research results were as follows ：（1） the contents of soluble sugar and soluble protein in ginkgo biloba leaves were lower than those in the control group at low concentration， but increased with the increase of the added concentration; The contents of free proline and total flavonoids in ginkgo biloba leaves and the ability of flavonoids to scavenging DPPH free radicals showed a trend of "up-decrease" with the increase of concentration， among which the three indexes of T2 treatment were the highest. （2） there was a moderate negative correlation between soluble sugar content and soluble protein content， free proline content and total flavonoids content， among which， there was a significant correlation between soluble sugar content and free proline content. There was a significant positive correlation between soluble protein content and free proline content with high strength， a positive correlation between free proline content and total flavonoids content with moderate strength， and a positive correlation between total flavonoids and its ability to scavenging DPPH free radicals. （3） based on the evaluation of membership functions， the processing ranking of the first sampling was T2>T4>CK>T1> T3， and the processing ranking of the second sampling was T2>T3>T4>T1>CK. To sum up， the extract of metasequoia metasequoia leaves has a certain allelopathic effect on ginkgo seedlings， which is promoted at medium and high concentration and inhibited at low concentration.

Key words Allelopathy;  Water extract;  Metasequoia;  Ginkgo;  Physiology and biochemistry