月季优质品系的高效繁殖体系研究

杨海牛，何超超，宁国贵，沙 飞

（1.武汉市花木有限公司，武汉 430000；2.华中农业大学园艺林学学院，武汉 430070）

月月粉（Rosa chinensis‘Pink China’）为典型的二倍体原始月季变种，花深紫红色，重瓣，四季开花［1］。月月粉本身不仅具有极高的观赏价值，而且其独特的开花习性对目前大多数流行月季、玫瑰等蔷薇属植物品种的改良有着广阔的空间和潜力。对蔷薇属木本植物成熟器官的再生研究，目前主要集中在月季上［2-5］。尽管专家学者们在不同程度上对该属木本植物再生进行了较为系统的研究，但就该类植物种类而言缺乏对其高效的植物再生与繁殖体系的研究。

Oosumit 等［6］通过对草莓的遗传转化体系进行研究，认为草莓基因组小、生长周期相对较短，可以作为蔷薇科相关基因功能研究的模式植物，但是草本植物的生长及开花习性与木本花卉有很大差别，因此用草莓作为材料进行蔷薇科相关基因功能研究具有一定的局限性。另外，虽然月月粉的体胚诱导及再生体系已经建立，但其色泽的单调也给研究蔷薇科木本植物的花色、花香相关代谢物带来困难。本研究从月月粉自交后代里找到月季品系月月红粉（Rosa chinensis‘Red and Pink’），其基因组不大，开花特殊、花深紫红色的月月红粉有望成为研究蔷薇科木本植物的模式植物。为此，本研究利用月月红粉叶片为外植体，建立了月月红粉愈伤诱导、体细胞胚发生及增殖与萌发为途径的高效月季繁殖体系。该体系从体细胞胚萌发、小植株形成、植株移栽至开花周期短，繁殖后代变异性少，不仅为月季等蔷薇科木本园艺作物的功能基因研究提供平台，同时为月月红粉的继续选育、评价与推广奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料及培养条件

试验材料为月月红粉的无菌苗叶片（图1A）。

基本培养基为MS 和1/2 MS（有机不变，其余减半），添加不同种类和浓度的植物生长调节剂，蔗糖30 g/L，琼脂7.5 g/L，pH 5.8～6.0，121 ℃高压灭菌 20 min。体细胞胚的基本培养基BM：MS+3% Glucose+0.3% GEL。培养温度（24±2）℃；光照条件：黑暗（0 lx）8 h、正常光（1 000～1 500 lx）16 h。

1.2 月月红粉愈伤组织诱导

以带小叶柄的无菌苗单叶为外植体，接种在含有不同类型、不同浓度植物生长调节剂的BM 培养基上，置于黑暗条件下培养，2 个月后统计愈伤组织的诱导率和观察愈伤的生长状态。愈伤组织诱导率=产生愈伤组织的外植体数/接种的外植体总数×100%，统计标准为愈伤组织长度≥5 mm。

1.3 体细胞胚的发生

将无菌苗的复叶自小叶柄基部切成带小叶柄的单叶并划伤叶脉，叶正面朝上接种于体细胞胚诱导培养基上置于黑暗条件下培养，培养4 个月后后统计体细胞胚诱导率。体细胞胚诱导率=产生体细胞胚的外植体数/接种的外植体总数×100%。

1.4 体细胞胚的增殖

将诱导所得的月月红粉体细胞胚接种到含2，4-D 和 BA 的 BM 培养基上，置于黑暗条件下培养，4 周后观察体细胞胚的生长状况。

1.5 体细胞胚的萌发、壮芽、成苗

将在诱导培养基上成熟体胚剥离，除去多余的愈伤组织，接种到萌发培养基1/2 MS+3% Glucose+0.3% GEL+1.0 mg/L BA+0.01 mg/L NAA 上光下培养20 d，观察萌发情况；剪取不定芽放入壮芽培养基MS+0.1 mg/L BA+0.05 mg/L NAA+3%蔗糖+7.5 g/L琼脂，待苗长到2～4 cm，移入生根培养基1/2 MS+0.05 mg/L NAA+3%蔗糖+7.5 g/L 琼脂。

1.6 数据分析

采用SAS 软件对数据进行方差分析，百分数在分析前进行平方根反正弦转化（y=arcsinx1/2）。

2 结果与分析

2.1 不同植物生长调节剂对月月红粉愈伤诱导的影响

叶片外植体在黑暗中培养8 周后，观察到外植体在不同培养基中表现出明显差异。由表1 的结果可知，用不同浓度2，4-D 与0.5 mg/L BA 配比能显著提高愈伤组织的诱导率。而且单独添加2，4-D 的愈伤组织生长状态最佳，愈伤组织的颜色光泽、质地更利于体细胞胚发生（图1B）。因此，2，4-D 是筛选出的月月红粉愈伤组织诱导的最佳植物生长调节剂。

图1 月月红粉胚性愈伤诱导、体细胞胚胎发生及植株再生

2.2 不同添加物对月月红粉体细胞胚发生的影响

添加物对月月红粉体细胞胚发生具有一定的促进作用。由表2 可知，单独添加L-脯氨酸（L-p）或AgNO3对体细胞胚诱导没有效果；在不含其他添加物的培养条件下，只有4.0 mg/L 的2，4-D 浓度能诱导体细胞胚的发生，体细胞胚诱导率为2.63%；而在同时添加 L-p 和 AgNO3的培养条件下，2，4-D 浓度为3.0、4.0、5.0 mg/L 均有体细胞胚发生，不同浓度梯度的体细胞胚诱导率之间差异显著，并且体细胞胚诱导率随着2，4-D 浓度的提高而提高，诱导率分别为2.93%、5.41%、5.72%。

表2 不同添加物对月月红粉体细胞胚发生的影响

2.3 不同外植体对月月红粉体细胞胚发生的影响

从表3 可以看出，复叶柄的愈伤诱导率高于小叶，且2，4-D 的浓度不影响其诱导率。但复叶柄体细胞胚的诱导产生需要更高浓度的2，4-D，高达6.0 mg/L。结果显示诱导复叶柄产生的体细胞胚状态较佳，增殖能力也强于小叶。

表3 月月红粉不同外植体的体细胞胚发生

2.4 2，4-D 和BA 不同浓度组合对月月红粉体细胞胚生长状态的影响

从表4 可以看出，在黑暗条件下，月月红粉体细胞胚在添加有不同浓度组合的2，4-D 和BA 培养基上均能增殖，但是在不同处理间的体细胞胚增殖系数差异显著。当 2，4-D 浓度为 1.0 mg/L，BA 浓度为0.05 mg/L 时，体细胞胚的增殖率达到最高，此浓度处理下的体细胞胚生长状态良好。因此，适合月月红粉体细胞胚增殖的培养基为：MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.05 mg/L BA+3%Glucose+0.3%GEL。

表4 2，4-D 和BA 不同浓度组合对月月红粉体细胞胚生长状态的影响

2.5 体细胞胚的萌发、壮芽、成苗

将体细胞胚置于萌发培养基1/2 MS+3% Glucose+0.3% GEL+1.0 mg/L BA+0.01 mg/L NAA 光照16 h，一周后出现绿色芽点（图1C），两周后出现小叶（图1D）；将芽点切下置于壮芽培养基MS+0.1 mg/L BA+0.05 mg/L NAA+3%蔗糖+7.5 g/L 琼脂，待苗长到2～3 cm 高时（图1E），将其切下置于生根培养基1/2 MS+0.05 mg/L NAA+3% 蔗糖+7.5 g/L 琼脂，15～20 d开花（图1F），待根长到3～5 cm，将其移入营养钵。

3 小结与讨论

目前，虽然已有月季的再生及转化的有关报道［3，7-10］，但是对于月月粉的研究尚在起步阶段，缺乏对原始特色月季变种等进行再生和转化的研究。本试验利用 2，4-D 并同时添加了 L-p 和 AgNO3，系统地建立了月月红粉愈伤诱导、体细胞胚发生及增殖与萌发为途径的再生体系。

在不同外植体诱导体胚过程中，复叶柄诱导产生体细胞胚的效率比小叶高，而且体细胞胚生长状态更好，增殖率更高。可能原因是其发育阶段不一致，导致其在内源激素种类和浓度并不一样。通过研究不同种类及其浓度梯度组合的激素对愈伤组织诱导率的影响，发现2，4-D 是月月红粉诱导的最佳植物生长调节剂。2，4-D 的添加提高了愈伤组织诱导率，同时为体细胞胚的发生提供更多的愈伤组织，经过2，4-D 诱导产生的愈伤组织有着更高的体细胞胚发生的可能性，这个现象与其他木本植物种类已有的相关报道一致［11，12］。此外，L-p 和 AgNO3的添加可以在诱导阶段改善愈伤组织的生长状态，提高体细胞胚发生的频率。与其相对应的解释可能为L-p作为氮源对体细胞胚的发生有一定的促进作用。此外，加入一定浓度的AgNO3对培养环境形成了Ag+胁迫，促进体细胞胚的发生。此现象与报道的在培养基中加入金属离子可以提高体细胞胚的发生频率，防止愈伤组织褐化和玻璃化相似［13］。

通过研究添加不同浓度梯度组合的2，4-D 和BA 对月月红粉体细胞胚生长状态及增殖的影响，发现BA 与2，4-D 组合对体细胞胚增殖的效果要优于仅分别单独添加2，4-D 或者BA 的培养基，这与在其他物种上报道的体细胞胚增殖的影响结果一致［14-16］。

利用月月红粉建立的体细胞胚植株再生体系从外植体到再生植株开花所需时间为6 个月左右，是目前报道的再生周期最短的木本植物。其再生模式不仅为月月红粉自身的改良，而且为用其作为模式材料进行蔷薇科相关基因功能的转基因研究奠定了基础。