戊糖片球菌发酵猕猴桃对面包香气与烘焙特性的影响

黄 璟 梁丽婷 OMEDI Jacob Ojobi 陈 诚 郭睿珺 黄卫宁 曾永青 李 宁 高铁成 周立源

(1. 江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；2. 深圳市金谷园实业发展有限公司，广东 深圳 518000；3. 广州市食品工业研究所，广东 广州 510663；4. 广州焙乐道食品有限公司，广东 广州 511400；5. 山东稻香村食品工业有限公司，山东 菏泽 274000)

猕猴桃富含碳水化合物、膳食纤维、氨基酸、有机酸等，营养丰富，极具开发潜力。将猕猴桃及其副产物添加到面包体系中不仅可以增强面包营养和种类[1-2]，还可以使面包中的多酚和膳食纤维等成分得到强化[3-4]。

Zhao等[5]将猕猴桃接种酿酒酵母以提升产品的风味物质，但其并未充分发挥猕猴桃本身风味，这是因为猕猴桃大多数风味物质(醇类、酯类和萜烯类)以不挥发的糖苷形式存在，而这些风味物质多数阈值较低，对风味贡献较大。β-葡萄糖苷酶作为水解糖苷类香气前体的关键酶类，常被作为风味酶用于果汁和果酒的增香。彭帅等[6]发现利用产β-葡萄糖苷酶菌株可以提升葡萄酒风味。但产β-葡萄糖苷酶的微生物大多为曲霉[7]、芽孢杆菌[8]和木霉[9]等，因此难以直接用于水果发酵。钱超等[10-11]从酒曲等中国传统发酵资源中分离出高产β-葡萄糖苷酶的乳酸菌，并将其作为发酵剂制作含葡萄汁的酸面团，面包中风味物质含量和种类得到了有效提升。但是其在猕猴桃及新型绿色健康烘焙食品中的研究尚未见报道。

文章拟以课题组前期分离自酒鬼酒曲的戊糖片球菌J8[10-13]为研究对象，研究乳酸菌发酵对猕猴桃理化特性及风味的影响，并将发酵猕猴桃引入到面包体系中，分析面包面团理化性质，评估其对猕猴桃面包烘焙和风味特性的影响，以期为工业化开发风味独特、烘焙品质优良的水果面包提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猕猴桃：海沃德品种，产自陕西周至；

高筋粉：河北参花面粉有限公司；

酵母：乐斯福(明光)有限公司；

MRS肉汤培养基：杭州百思生物技术有限公司；

戊糖片球菌(PediococcuspentosaceusKID7)J8：产β-葡萄糖苷酶，筛选自酒鬼酒曲；

对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、庚酸甲酯、三氯乙酸：分析纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司；

苹果酸、柠檬酸、乳酸、奎宁酸和乙酸：分析纯，上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

切片机：SM-302型，新麦机械(无锡)有限公司；

pH计：FE20型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

恒温恒湿培养箱：SPX-150C型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；

三重四极杆气质联用仪：TSQ Quantum XLS型，美国赛默飞世尔科技公司；

电子舌：SA402B型，美国Isenso 公司；

质构仪：CT3型，美国Brookfield公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵猕猴桃的制备 将戊糖片球菌J8于37 ℃的MRS液体培养基中培养24 h，8 000×g离心15 min，收集细胞，在灭菌生理盐水溶液中洗涤两次(质量分数0.85%)，用作发酵剂发酵猕猴桃(K-J8)，初始接种量为108CFU/mL。使用搅拌机将猕猴桃(可溶性固形物含量17.33 °Brix)搅拌成果泥，称取100 g于121 ℃灭菌10 min，室温冷却10 min。将发酵剂接种至灭菌猕猴桃(WK)，27.5 ℃、180 r/min下培养15.5 h。

1.3.2 发酵过程中pH、TTA和菌落数测定 参照邹奇波等[14]的方法。

1.3.3 发酵过程中β-葡萄糖苷酶酶活测定 参照钱超等[10]的方法。

1.3.4 发酵过程中有机酸含量测定 取5 g样品于20 mL KH2PO4溶液(0.01 mol/L)中，均质5 min，4 ℃、5 000×g 离心10 min，上清液过0.22 μm膜，将20 μL样品通过HPLC测定有机酸含量(乳酸、乙酸、苹果酸、柠檬酸和奎尼酸)。色谱条件：C18色谱柱(250 mm×4.6 mm)，流动相为10 mmol/L KH2PO4，pH 2.6，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，波长215 nm。

1.3.5 发酵过程中风味化合物含量测定 称取5.0 mL样品于20 mL样品瓶。将样品瓶插入SPME萃取头(50/30 μm CAR/PDMS/DVB)，50 ℃萃取30 min。250 ℃ 热解吸3 min，进行GC-TOF/MS分析。色谱条件：DB-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为N2，流速1 mL/min。升温程序：40 ℃保持2 min，以10 ℃/min升至250 ℃，恒温6 min。进样、界面和离子源温度分别为250，250，200 ℃。电子撞击能量70 eV。

1.3.6 猕猴桃面包的制作 小麦面包(XB)、未发酵猕猴桃面包(WKB)和发酵猕猴桃面包KB-J8配方见表1。制作流程：将原料(除黄油外)倒入搅拌缸，慢搅3 min，快搅1 min；加入黄油后慢搅3 min，快搅2 min。搅拌后滚圆并松弛5 min，分割成90 g，松弛10 min，整形，置于模具，醒发90 min(38 ℃，85%)，放入烤箱(上火170 ℃，下火210 ℃)烘烤21 min。

表1 面包配方

1.3.7 面团的α-淀粉酶和蛋白酶酶活测定

(1)α-淀粉酶：参照Wang等[15]的方法。

(2) 蛋白酶：参照Thiele等[16]的方法。

1.3.8 面包烘焙特性测定

(1) 比容和硬度：参照吴玉新等[17]的方法。

(2) 膳食纤维含量：参照曹伟超等[18]的方法。

(3) 色泽：参照Sharma等[19]的方法。

1.3.9 面包游离氨基酸含量测定 参照刘若诗等[20]的方法。

1.3.10 电子舌分析 参照武盟等[21]的方法。

1.3.11 面包风味化合物含量测定 参照张薇等[22]的方法。

1.3.12 面包感官评定 采用9分嗜好法[22]。由20位经过培训的人员(男女各一半)对面包外观、色泽、组织结构、口感、风味以及整体可接受度进行评分。

1.4 数据处理

采用Excel 2015、Origin 9.5以及SPSS 26.0软件进行数据分析，显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 猕猴桃发酵过程中pH、TTA和菌落数变化

由表2可知，猕猴桃发酵15.5 h后，K-J8菌落数达108CFU/mL，表明戊糖片球菌J8在猕猴桃基质中适应性良好。与其他乳酸菌发酵体系相比，其菌落数比发酵火龙果体系高1～2个数量级[23]。猕猴桃pH值显著降低，TTA值显著增加(P<0.05)，表明戊糖片球菌J8发酵猕猴桃过程中产生了有机酸，如乳酸和乙酸等，而这些化合物能够促进风味物质形成[24]。

表2 猕猴桃发酵前后的菌落数、pH和TTA†

2.2 猕猴桃发酵过程中β-葡萄糖苷酶酶活变化

由图1可知，发酵初期，β-葡萄糖苷酶酶活逐渐增加，6 h后酶活最高，达61.14 U/L，9 h后小幅下降，随后趋于平缓直至发酵完成，其最终酶活为55.13 U/L，这与菌株的生长特性、对水果基质适应能力以及水果基质中代谢物相关[25]。较高的β-葡萄糖苷酶酶活有利于释放猕猴桃糖苷风味前体物质。

图1 猕猴桃发酵过程中β-葡萄糖苷酶酶活变化

2.3 猕猴桃发酵过程中有机酸含量变化

由表3可知，发酵后奎宁酸、柠檬酸和苹果酸含量均显著降低(P<0.05)，分别降低了11.62%，20.26%，57.07%(P<0.05)，其中苹果酸含量降幅最大。乳酸菌通过苹果乳酸发酵产生乳酸，也可以代谢柠檬酸产生乳酸、丙酮酸和乙酸。因此发酵后乳酸和乙酸含量显著增加(P<0.05)，与Wei等[26]的结果相吻合。乳酸是乳酸菌的主要关键代谢产物，能赋予发酵食品愉悦感受[27]；乙酸是乙酸乙酯的前体，本身带有愉悦醋香味[28]。

表3 发酵猕猴桃的有机酸含量变化†

2.4 发酵猕猴桃的风味化合物变化

由表4和表5可知，2种样品中共检出110种风味物质，与WK相比，K-J8的种类和含量分别增加了39.39%，94.90%。乳酸菌发酵后，酸类、酯类、醇类和萜烯类化合物含量增加，尤其是醇类和酯类，醛类和酮类化合物含量降低。WK和K-J8中共有化合物48种，主要以醇类、醛类和酮类居多，包括乙醇、己醛和乙酸乙酯等。戊糖片球菌发酵后增添了44种风味物质，以醇类和酯类为主，这与菌株发酵产生的特殊风味物质和β-葡萄糖苷酶水解糖苷产生的不同风味物质前体有关。

表4 发酵猕猴桃风味化合物含量的影响

续表4

表5 猕猴桃不同挥发性风味化合物统计

醇类是乳酸菌发酵过程中重要的挥发性香气[29]，12种醇类在乳酸菌发酵后含量增加，如芳樟醇(铃兰香)和α-松油醇(百合、紫丁香)，这些化合物以糖苷形式结合在猕猴桃中[30]，阈值较低，对产品风味具有积极影响。酯类提供水果宜人的花果香，其阈值一般较低。发酵猕猴桃中增加的酯类多为乙酸酯(乙酸甲酯和乙酸乙酯等)，是因为猕猴桃中氨基酸或碳水化合物降解产生的高级醇与乙酰辅酶A反应[31]，从而增加乙酸酯含量。萜烯类化合物是水果的典型香气特征，常以糖苷键结合的形式出现在猕猴桃中[32]。K-J8中新的萜烯类化合物为α-蒎烯(雪松、松木)。

WK中主要风味化合物为戊醛(绿色、麦芽)、糠醛(杏仁、焦香)、(E)-2-己烯醛(绿色、青草)和己醛(青草)，较高的糠醛含量可能源于维生素C在无氧和热的作用下形成糠醛[33]。而K-J8中主要为乙酸乙酯(甜香、菠萝味)、3-甲基-1-丁醇(香蕉、花香)、乙醇(果香、花香)、1-己醇(花果香)、乙酸异戊酯(苹果、香蕉)、2-甲基-丁醛(麦芽)和1-戊醇(水果香)，这些化合物均呈花香和果香，赋予猕猴桃丰富且浓郁的风味。戊糖片球菌发酵后，猕猴桃中有3种新风味化合物，分别为α-当归内酯(甜草药香)、乙酸糠酯和泛酸内酯(棉花糖、烤面包)。乙酸糠酯被广泛用作食品和面包房中的调味剂，可通过糠醇与乙酸的原位酯化形成[34]。综上，戊糖片球菌J8发酵增加了猕猴桃的风味物质含量及种类，改善了猕猴桃的风味。

2.5 发酵猕猴桃面包面团α-淀粉酶和蛋白酶活力变化

由图2可知，WB的α-淀粉酶活和α-氨基态氮含量最低，而KB-J8的α-淀粉酶活力和α-氨基态氮含量较WKB分别提高了14.86%，18.63%，表明猕猴桃的添加和乳酸菌发酵均可提高α-淀粉酶和蛋白酶活力。其原因在于猕猴桃富含的有机酸和乳酸菌发酵产生的大量乳酸、乙酸等有机酸激活了小麦粉中内源性α-淀粉酶和蛋白酶活力，同时乳酸菌自身也会分泌α-淀粉酶和蛋白酶[35]。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.6 发酵猕猴桃面包的烘焙特性

由表6可知，与WKB相比，采用戊糖片球菌J8发酵的KB-J8的SDF含量提高了12.54%，这与其较高的β-葡萄糖苷酶酶活有关。β-葡萄糖苷酶是重要的纤维素水解酶，可促进纤维降解生成小分子可溶性多糖[36]，供乳酸菌和酵母菌利用。WKB面包比容最小，主要是因为纤维素会削弱或破坏面团面筋网络结构，从而导致持气能力降低。与WKB相比，KB-J8面包比容提高了18.59%，硬度下降了11.58%。添加猕猴桃后，面包皮L*值从72.10降至65.02，a*、b*值显著增加(P<0.05)，ΔE均大于6，即猕猴桃的添加导致面包亮度减少，红黄度增加，表皮颜色变化显著，添加发酵猕猴桃后面包色泽进一步加深，与KB-J8中较高的α-淀粉酶和蛋白酶酶活相符。淀粉和面筋蛋白的水解使美拉德反应底物含量增加，从而导致褐变，面包色泽变化更加明显。

表6 不同面包烘焙特性评估†

2.7 发酵猕猴桃面包游离氨基酸含量

由图3可知，相对于XB，WKB总游离氨基酸含量(57.00 mg/100 g)为XB的1.10倍，是因为猕猴桃本身含有多种氨基酸。经乳酸菌发酵后，KB-J8中总游离氨基酸含量达80.38 mg/100 g，与WKB相比提高了41.02%，与蛋白酶活性测定结果相符。支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)、芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸)和含硫氨基酸(甲硫氨酸和半胱氨酸)是形成风味化合物的主要氨基酸[37]。KB-J8面包中缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、半胱氨酸含量均比XB和WKB高，这5种物质总量较WKB提升了2.32倍。通过Ehrlich途径可将缬氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸转化为2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇和苯乙醇，而这3种物质都是面包中重要的风味物质。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.8 发酵猕猴桃面包滋味分析

由图4(a)可知，WKB和KB-J8的整体滋味指标显著高于小麦面包，与猕猴桃较高的有机酸(苹果酸和柠檬酸等)、糖类(葡萄糖、果糖)和呈味氨基酸含量有关。与WKB相比，KB-J8的酸味、甜味、鲜味、鲜味增加，涩味和苦味降低。WKB与KB-J8的甜味、酸味、滋味差异源于乳酸菌发酵代谢产酸、淀粉降解和较高含量的呈味氨基酸。KB-J8中较高含量的丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸可增加甜味，较高的谷氨酸和天冬氨酸含量可赋予鲜味同时还可抑制苦味。KB-J8的苦味和涩味值均低于WKB，与其较低的奎宁酸含量相关，奎宁酸阈值较低，对苦味和涩味贡献较大。

由图4(b)可知，主成分总方差贡献率达95.96%，能反映样品大部分信息。XB、WKB和KB-J8的整体滋味特性在主坐标轴具有良好的区分度，WKB与苦涩味相关、而KB-J8与甜酸鲜咸味相关，说明发酵和未发酵猕猴桃的添加对面包整体滋味特性的提升具有显著性差异(P<0.05)。

图4 发酵猕猴桃面包的滋味特征及主成分分析

2.9 发酵猕猴桃面包挥发性风味化合物含量变化

由图5(a)和表7可知，3组面包共检出102种风味物质，包括39种醇类、10种酸类和22种酯类等。XB的种类和含量最低，KB-J8的种类和含量较WKB分别增加了45.10%和27.78%。

表7 面包风味化合物含量†

续表7

续表7

图5 面包的风味化合物变化、维恩图和热图

由图5(b)可知，3组面包中均检出25种共有风味化合物，包括乙醇(果香、花香)、1-己醇(花果香)和辛酸乙酯(菠萝、香蕉)等，主要以醇类为主。K-J8和KB-J8中均检出17种共有化合物，包括3-甲基-1-丁醇(香蕉、花香)、2-甲基-1-丙醇(苹果、麦芽)和乙酸乙酯(甜香，菠萝)等，以醇类居多。将其中43种面包主要风味物质的含量标准化后进行聚类热图分析，由图5(c)可知，不同挥发性风味物质含量在不同面包中差异显著(P<0.05)。

醇类化合物是面包风味的重要组成部分。发酵后，KB-J8中乙醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇和3-甲基-2-丁醇含量均显著提升，与发酵猕猴桃风味检测结果相符。且KB-J8中缬氨酸和亮氨酸含量最高，这两种氨基酸可通过Ehrlich途径分别转化形成2-甲基-1-丙醇和3-甲基-1-丁醇。KB-J8中产生了一些在WKB和XB中未检出的新不饱和醛类物质，如2-壬烯醛(黄瓜)、(E,E)-2,4-癸二烯醛(黄瓜)和月桂醛(柑橘)等。这些不饱和烯醛类物质阈值比饱和醛类更低，可赋予面包更加丰富、浓郁的风味[38]。酯类化合物大多呈果香和花香，KB-J8中酯类种类和含量最高，WKB次之。KB-J8中还检测到内酯类化合物：壬基内酯(桃子)和δ-癸内酯(椰子、桃子)，内酯可通过微生物作用、深度的脂类氧化或加热形成。

2.10 发酵猕猴桃面包感官评价

由图6可知，KB-J8的整体可接受度评分最高，而WKB的外观评分最低，这与其低比容和高硬度有关。WKB中较高的总膳食纤维含量破坏了面团面筋网络结构，苦涩味突出，因而组织结构和口感评分较低。发酵后，WKB的比容与硬度得到改善，KB-J8的外观饱满、质地松软，外观和口感评分均优于WKB。KB-J8中因富含更多香气物质而获得较高风味评分(7.7)，其较高的游离氨基酸含量易于发生美拉德反应，产生令消费者喜爱的焦黄色泽，因此在色泽方面评分最高，与面包风味化合物和颜色分析结果相符合。

图6 面包感官评定

3 结论

利用酒鬼酒曲中筛选的戊糖片球菌J8发酵猕猴桃并制成面包。结果表明，经戊糖片球菌J8发酵猕猴桃后，奎宁酸、柠檬酸和苹果酸含量均降低，乳酸和乙酸含量均显著增加(P<0.05)；风味物质种类和含量均提高，以醇类、醛类和酯类化合物为主。猕猴桃中发现了3种新的风味化合物：α-当归内酯、乙酸糠酯和泛酸内酯。与未发酵猕猴桃面包相比，发酵猕猴桃面包KB-J8面团的α-淀粉酶和蛋白酶活力分别提高了14.86%和18.63%，其面包的可溶性膳食纤维含量和总氨基酸分别增加了12.54%和41.02%。烘焙特性方面，KB-J8的比容提高了18.59%，硬度下降了11.58%。风味特性方面，乳酸菌发酵后面包风味物质种类和含量增加，甜味、酸味、鲜味和咸味均优于WKB，风味特性整体得到改善，同时感官评价指标得分均优于WKB。说明该株戊糖片球菌J8发酵猕猴桃在增加可溶性膳食纤维含量，提升氨基酸含量，改善面包风味和烘焙特性等方面具有良好的应用潜力。后续可将该株产β-葡萄糖苷酶戊糖片球菌与马克斯克鲁维酵母混菌发酵进一步改善发酵猕猴桃体系，实现混菌发酵的协同作用，改善发酵猕猴桃面包的烘焙品质与香气特征。