SMILE来源的角膜基质透镜研究进展

刘雪珂，李 霞，刘 毅

0引言

自2011年以来，飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术(small incision lenticule extraction,SMILE)得到了广泛的开展[1]。SMILE是利用飞秒激光精准聚焦定位的立体切割技术，在角膜基质层内进行两次不同深度的扫描，切割出具有一定大小和厚度的片状角膜组织，这片被取出的角膜组织即角膜基质透镜。由于角膜基质透镜来源于活体，取材方便，近年来一些学者开始探索和利用它们。随着研究的深入，角膜基质透镜得到广泛的应用，本文就角膜基质透镜的结构特点、保存方法及其在眼科中的应用进行综述。

1角膜基质透镜的特点

角膜基质透镜是角膜基质层中央区的前层组织，由有序排列的胶原纤维构成，其间无血管及淋巴组织，其正常的解剖结构和生理功能对维持角膜透明度及生物具有重要意义。根据预计矫正的屈光度数的不同，角膜基质透镜中央厚、周边薄，直径6.0～6.5mm，厚度60～130μm。Yin等[2]描述了SMILE过程中提取的新鲜角膜基质透镜组织学和形态学特征，在光学显微镜下，角膜基质透镜横切面边缘可见部分毛刺和胶原纤维断裂，肿胀的角膜基质纤维呈不规则分布。在电子显微镜下，可看到用飞秒激光消融的透镜表面并不完全光滑，前表面稍比后表面光滑，表面可见胶原纤维坏死、溶解，可见使用飞秒激光切割的角膜基质透镜的表面质量并不是最佳的。Bandeira等[3]发现角膜基质透镜中神经突密度与其厚度呈负相关，而角膜基质中轴突总长度与厚度的关系不明显。兴奋性钙反应试验是评估角膜基质透镜中神经突的功能，经4℃和液氮保存后兴奋性钙反应明显减少，这可能是由于冷冻和解冻期间的低温效应影响神经突的活性，导致细胞内钙运动停止，因此进一步研究冷冻保存条件(包括冷冻保存介质的类型、冷冻和解冻时间，以及逐步的温度变化)可能会提供关于保存神经突活性的信息。透射电镜下可见施万细胞(Schwann cells,SCs)与神经突关系密切。在SCs和兴奋性钙反应的存在下，这些残留的神经突可以保留最低的功能，这可能是角膜基质透镜植入的潜在优势，可能会影响植入后的神经再支配。

2角膜基质透镜保存方法

从SMILE术中取出的新鲜角膜基质透镜最大程度保留了原有的组织和结构，但因受时间、地点的限制，可能不能立即投入使用，我们可以先将其储存起来，以便以后需要时重新取出。不同的保存方法对角膜基质透镜的厚度、透明度、机械性能等改变也是不同的，因此无论是将角膜基质透镜用于基础实验还是临床研究，选择合理的储存方式显得尤为重要。

在SMILE开展之前，一些学者已经对角膜的保存进行研究[4]。Mohamed-Noriega等[5]对保存在Optisol培养基的人体角膜行飞秒激光角膜基质透镜切除术，将提取的角膜基质透镜分为新鲜组和冷冻保存组，结果发现两组均可看到死亡的细胞，但冷冻保存组中有足够的活性角膜基质细胞，可以在保存1mo后分离和增殖。这种冷冻保存方式除了胶原纤维密度降低外，仍保持了角膜基质细胞的活性和整体胶原结构的完整性。Ganesh等[6]对Mohamed-Noriega等[5]的技术进行了改进，即用人组织培养液代替牛血清白蛋白，这是为了消除人畜共患病传播和牛血清引起不良反应的风险。

虽然已开发的冷冻保存方法可保存角膜基质透镜，但因技术复杂和成本较高，限制了应用。早在1954年，Mcnair等[7]首次报道了用95%的甘油在真空下保持角膜脱水状态。范军华等[8]对传统甘油保存方法进行改良，通过电镜观察到这种方法保存的角膜结构完整。另外无水氯化钙法同甘油一样也属于干燥脱水法，通过临床观察发现在角膜透明度方面，无水氯化钙法优于甘油保存法[9]，透射电镜和组织切片可见经无水氯化钙保存后的角膜组织结构与新鲜的无明显差异，角膜基质层胶原纤维排列均匀[10]。

为了探究温度和辅助脱水剂对长期保存在甘油中的人角膜组织的作用，Tripathi等[11]发现与-20℃或4℃相比，甘油保存的人角膜组织在-80℃具有更好的无菌性、厚度、光学透明度、机械强度和超微结构特征，且抗原性小。Romano等[12]将刮除上皮和内皮的角膜基质放入硅胶中，在室温下保存2wk后复水，结果发现人体角膜基质可在脱水状态下保存2wk，脱水和复水过程对基质的厚度、透明度和生物力学性能没有明显的影响。

Liu等[13]发现保存于磷酸盐缓冲溶液、DMEM、Optisol GS和100%无水甘油的角膜基质透镜均能保持其透明度和完整的结构，同时具有较低的免疫原性。Liang等[14]比较了99%无水甘油、变色硅胶和Optisol培养基的保存效果，发现经这三种方法保存后水肿程度和胶原纤维密度随着时间的推移逐渐恶化，无水甘油中较为明显。在角膜透明度方面，Optisol组最好，硅胶组次之。在Optisol组中细胞活性和胶原纤维结构的完整性在保存前后保持不变。Xia等[15]进行了类似的研究，两者[14-15]除保存时间不同外，均发现甘油保存的角膜基质透镜比其他组有更严重的水肿和更低的胶原纤维密度。Shang等[16]研究发现-78℃无水甘油保存不仅可以达到0.1%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)降低抗原的效果，而且可以避免其对正常胶原纤维结构和角膜基质的光学和力学性能的破坏，是获得高质量移植物较为理想的方法。

甘油是一种无味、无色的黏性液体，具有优异的脱水和抗菌性能，并且可以维持角膜的结构，其用途已得到广泛证实。硅胶是一种非活性防腐保存技术，通过去除角膜组织中的水分，防止细胞酶失活，抑制组织细胞自溶，从而保持组织细胞的完整性。无水氯化钙是一种吸水性很强的干燥剂，能迅速吸收角膜中的水分，完整地保存具有一定活性的角膜组织，是眼库长期保存角膜的方法之一。Optisol是目前国际上最常用的中期保存液，可安全有效保存角膜组织。但Optisol成本高，与Optisol相比，甘油大大降低了成本，而且甘油可以很明显地降低角膜组织中的细胞密度和抗原性，最大限度地减少免疫排斥反应，加上操作简单易行，在我国许多基层医院仍为实用性较强的保存方法。

3角膜基质透镜的应用

3.1矫正远视及散光已有报道证实使用SMILE来源的自体或同种异体角膜基质透镜植入术均可以矫正远视[17-18]。虽然发现同种异体角膜基质透镜植入术出现过少数排斥反应，但其手术的可预测性和稳定性优于传统的准分子激光原位角膜磨镶术(laserinsitukeratomileusis, LASIK)，为中高度远视患者提供了一个更安全、有效的手术方式。Liu等[19]第一次对SMILE、LASIK、自体角膜基质透镜植入术三种远视矫正方式进行比较评估，发现在低度远视治疗中，角膜基质透镜植入术在高阶像差方面有良好的发展趋势。

在前期研究的基础上，Zhang等[20]首次报道了使用SMILE联合角膜基质透镜植入术治疗远视合并散光的患者。该手术最关键的一步是保证术中中心对齐，术中用核黄素溶液进行等心定位。随访1a后所有角膜均保持透明，术中、术后未出现并发症。凌玲等[21]提出一种角膜基质透镜散光标记盘，用于透镜的盛载检查、标记和定型。该方法可有效矫正散光，部分患者术后仍存在散光，可能与角膜愈合的不确定性及散光轴向的手工定位及标记等因素有关，尽管如此，散光标记器还是为远视伴散光患者提供了新的、有效的手术方式。

3.2角膜病角膜病是我国的第二大致盲眼病,目前角膜盲最难解决的瓶颈问题是角膜供体严重不足。面对日益增长的需求与角膜供体材料短缺之间的矛盾，寻找新的角膜材料来源是目前解决这一问题的重要手段。SMILE来源的角膜基质透镜在一定条件下可以替代角膜植片，用于一些角膜相关疾病的治疗。

3.2.1圆锥角膜Ganesh等[22]首次采用飞秒激光辅助角膜基质透镜植入联合加速胶原交联术(collagen crosslinking,CXL)，研究其在进展性圆锥角膜(keratoconus,KC)和角膜塑形镜不耐受患者中的扁平化效果、屈光状态和安全性结果，术后所有患者均未出现排斥反应，裸眼远视力、矫正远视力和等效球镜均改善，角膜厚度均增加，只有1眼角膜曲率未下降，可能因其是晚期KC。Doroodgar等[23]报道了一种治疗晚期KC的新方法，即定制角膜基质透镜植入术，将定制的复合型(项链型+120°戒指型)或项链形状的透镜植入晚期KC，术后6mo最佳矫正视力均提高，角膜总屈光度下降，角膜厚度增加。总之，角膜基质透镜植入术是矫正KC患者的屈光度、增加角膜厚度、调节角膜曲率的一种可行的治疗方案，但是否需要联合CXL以及术后屈光结果的准确性和可预测性仍然需要进一步研究[24]。

3.2.2角膜穿孔Wu等[25]第一个成功将-80℃保存的角膜基质透镜用于治疗疑难、紧急角膜穿孔患者，该研究认为角膜基质透镜可能是立即闭合角膜穿孔损伤的最佳选择。Jiang等[26]也得出同样结论。由于单个透镜厚度较薄且韧性有限，不利于术中辨识和操作，几个透镜联合移植操作困难且耗时，叠加对位不准确或比较松散时，有可能导致植片结构不稳定，延迟角膜上皮愈合。姚涛等[27]使用吲哚菁绿染色剂将基质透镜染色后再置于-40℃保存，并将其用于治疗角膜穿孔患者，术中应用纤维蛋白胶黏合多层角膜基质透镜后，再用10-0尼龙线间断缝合固定。所有患者术中操作顺利，术后发现染色剂可被迅速代谢，对角膜上皮愈合无影响。所有患者均在1wk内完全上皮化，未出现移植物融解等并发症。联合应用纤维蛋白胶和吲哚菁绿染色，可方便手术操作，提高手术成功率。王曙亮等[28]的实验研究中再次证明用纤维蛋白胶构建的角膜基质植片能安全、可靠且有效地修复前部受损角膜，为角膜穿孔的治疗提供了新途径。

3.2.3Mooren溃疡和翼状胬肉共存He等[29]报道了第一例使用角膜基质透镜治疗Mooren溃疡与翼状胬肉共存的病例。1例61岁女性患者在接受了近3mo的局部免疫抑制和抗感染治疗后，眼部症状和体征并没有明显改善。在保守治疗失败后，使用低温保存的SMILE来源的角膜基质透镜行板层角移，并行翼状胬肉切除联合自体结膜移植术。该手术是为了维持角膜结构、防止疾病进展。手术的成功表明，如果保守治疗失败，联合手术可能是治疗Mooren溃疡和翼状胬肉共存的有效方法。

3.2.4角膜皮样瘤李世洋等[30]采用SMILE术获得的角膜基质透镜作为板层角膜移植材料，并联合羊膜移植治疗角膜皮样瘤，取得满意效果。在前人的基础上，苏红等[31]进一步尝试在不使用羊膜移植的情况下，也取得了满意的效果。为了美观，Jacob等[32]切除病变组织后，用染料在预定的角膜缘染色，再使用纤维蛋白胶黏贴角膜基质透镜和结膜，术后患者对外观和屈光效果均较满意。角膜染色被认为是一种安全有效的技术，但也报道过各种并发症，如严重的毒性反应、角膜融化、肉芽肿性角膜炎、持续性上皮缺损等。Pant等[33]使用10-0尼龙缝线替代纤维蛋白胶最大限度地降低了移植物复发、角膜上皮糜烂和肉芽肿性角膜炎等风险，这些在使用纤维蛋白胶时常见。Wan等[34]也使用10-0尼龙缝线间断缝合角膜基质透镜，尽管这会增加手术时间，导致不规则散光，但它比纤维蛋白胶更加固定，随访期间所有患者的视力和散光均有改善的趋势。

3.2.5准分子激光角膜原位磨镶术后角膜扩张已有研究表明角膜基质透镜用于治疗LASIK术后角膜扩张症是一种安全有效的手术方法。Li等[35]第一个从细胞水平表征LASIK术后角膜扩张的同种异体基质内透镜植入后伤口愈合的过程。研究结果显示，在受体角膜与植入基质透镜的交界处，角膜基质细胞的密度和形态在初期减少和变形后又逐渐恢复，还发现供体的角膜基质透镜神经纤维再生。

3.3角膜基质透镜在青光眼小梁切除术中的应用Yin等[36]将来源于SMILE新鲜的角膜基质透镜用氯化钠和核酸酶脱细胞后，置于-80℃平衡盐溶液中保存备用，对兔行小梁切除术，将脱细胞的角膜基质透镜固定于结膜下间隙。术后观察到脱细胞角膜基质透镜可显著增加滤过泡存在时间，降低眼压，且无不良反应。组织病理学结果显示脱细胞组结膜下间隙较大，结膜下纤维化较轻。本研究首次证实了脱细胞的角膜基质透镜可预防兔眼小梁切除术术后结膜-巩膜黏连和纤维化，这可能是小梁切除术中一种新的抗纤维化方法，但其安全性和有效性仍需进行更大样本量和更长随访时间的研究。

4总结与展望

角膜基质透镜具有生物相容性好、易操作、成本低等优点，在当前角膜组织供源远远供不应求的状况下，选择SMILE来源的角膜基质透镜在某些情况下作为替代品也是一种不错的选择。虽然角膜基质透镜在治疗远视、散光、角膜穿孔和圆锥角膜等眼科疾病中有着不错的应用效果，但角膜基质透镜矫正远视及散光、圆锥角膜术后视力的可预测性仍有待提高，对于远视合并散光患者术中角膜基质透镜的定位是较为关键的步骤，目前仍有待进一步研究。角膜基质透镜的表面质量也有待改善，一旦角膜基质透镜具有更完美的表面质量，更多角膜材料将用于治疗角膜疾病。角膜基质透镜的保存方法各有其特点，选择合适的保存方法才能更好地用于临床。随着我们深入的研究，角膜基质透镜有望能够在更多方面应用。