宁夏人腺病毒临床标本的首次全基因组序列分析

李宗倍，朱 亮，王新宁，吴忠兰

（1.宁夏医科大学公共卫生与管理学院，银川 750004；2.宁夏环境因素与慢性病控制重点实验室，银川 750004；3.宁夏疾病预防控制中心，银川 750000；4.宁夏银川市金凤区疾病预防控制中心，银川 750000）

人腺病毒属于腺病毒科哺乳动物腺病毒属，是无包膜的双链DNA病毒[1]。人腺病毒全基因组长约36 kb，在感染后的不同时间转录，生成早期（E）、中期（I）和晚期（L）区域转录产物[2]。目前，已知的腺病毒都呈二十面体结构，由7个不同的衣壳蛋白组成，包括3种主要衣壳蛋白（六邻体、五邻体以及纤维蛋白）和4种次要衣壳蛋白（Ⅲa、Ⅵ、Ⅷ和Ⅸ）[3]。截至目前，腺病毒可划分为7个亚属（A～G），包括111个基因型，其中人腺病毒C亚属包括HAdV-C1、HAdV-C2、HAdV-C5、HAdVC6、HAdV-C57、HAdV-C89、HAdV-C1047个基因型。

人腺病毒是导致多种人类疾病的常见病原体，如急性呼吸道疾病、结膜炎、胃肠炎、泌尿系感染和脑膜脑炎等[4]。腺病毒占儿童呼吸道感染的2%～15%[5-8]，并且呈逐年升高的趋势[9]。人腺病毒B（HAdV-B3、7、11、14、16、21和55）、C（HAdVC1、2、5和6）和E（HAdV-E4）亚属通常与急性呼吸道疾病有关，HAdV-C是幼儿急性呼吸道感染的主要病原体[10]。

2020年，在宁夏中卫市海原县1例核酸检测阴性的发热患儿咽拭子标本中检测到人腺病毒。本课题组对此标本进行全基因组测序，并对其进行进化分析。

1 材料与方法

1.1 标本来源

标本来源于2020年2月宁夏中卫市海原县1例有发热症状、新冠肺炎筛查时核酸检测阴性的2岁幼儿的咽拭子标本。该患儿体温38.5℃，血常规：白细胞（WBC）12.37×109/L，淋巴细胞（lymphocyte，LYMPH）4.70×109/L，淋巴细胞百分比38.0%，CT提示双肺未见实变影。

1.2 试剂与仪器

核酸磁珠法快速提取试剂盒（江苏硕世生物科技股份有限公司），呼吸道腺病毒核酸检测试剂盒（上海伯杰医疗科技有限公司），核酸提取仪器为江苏硕世全自动核酸提取仪，PCR扩增仪为ABI 7500 Fast。

1.3 标本核酸检测

按照核酸快速提取试剂盒（磁珠法）说明书，取200μL标本提取病毒核酸。按照呼吸道腺病毒核酸检测试剂盒说明书设置反应条件，进行实时荧光定量PCR检测。

1.4 全基因组序列测定

取600μL临床标本送至上海伯杰医疗科技有限公司进行全基因组测序，并拼接成1条完整序列。

1.5 生物信息学分析

先将测序结果进行Blast比对，初步判定型别。再从美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）下载HAdV-C原始株和代表株[11]。使用MAFFT[12]（版本号7.490）进行多序列比对。使用trimAl[13]（版本号1.2）对多序列比对结果进行过滤。使用BioEdit（版本号7.0.9.1）进行同源性分析。使用MEGA（版本号7.0）构建最大似然法系统发育进化树，Bootstrap设置为1 000。使用SplitsTree[14]（版本号4.18.2）默认设置构建全基因组网状进化树。使用Simplot[15]（版本号3.5.1）进行重组分析，窗口大小设置为5 000，步长设置为100。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR检测结果

对该幼儿咽拭子标本中的病毒核酸进行实时荧光定量PCR检测，检测结果显示人腺病毒核酸DNA阳性（CT值为21.11），证明该咽拭子标本为腺病毒阳性。

2.2 核酸序列的同源性分析

该咽拭子标本全基因组长度为35 965 bp，基因组G+C的含量为55.22%。分别与人腺病毒C亚属7个原始株进行全基因组比较，同源性分析结果见表1，与HAdV-C1、2、5、6、57、89、104的同源性分别为95.2%、99.5%、94.5%、97.0%、96.5%、98.5%、98.3%。该标本全基因组与HAdV-C2原始株同源性最高。

表1 宁夏标本全基因组与人腺病毒C亚属原始株全基因组的同源性比较

2.3 系统发育分析

Ningxia2020腺病毒全基因组系统发育进化分析表明，Ningxia2020腺病毒与HAdV-C2聚为一类（图1）。五邻体、六邻体和纤维蛋白基因的系统发育进化分析表明，这3个主要抗原基因分别属于P104（图2）、H2（图3）和F104（图4）。

图1 基于全基因组的系统发育进化树

图2 基于五邻体基因区域的系统发育进化树

图3 基于六邻体基因区域的系统发育进化树

图4 基于纤维蛋白基因区域的系统发育进化树

2.4 基因进化分析

SplitsTree全基因组网状进化树结果显示，Ningxia2020腺病毒位于HAdV-C2进化分支内，且与MF315028.1株腺病毒存在高度相似进化关系（图5）。

图5 基于全基因组构建的HAdV-C网状进化树

2.5 基因重组分析

Simplot软件Bootscan重组分析结果显示，HAdV-C89原始株可能在nt9000～12000参与了重组，HAdV-C104原始株可能在nt12000～16000（其中包括Penton基因）和Fiber基因发生重组，HAdV-C2原始株可能在nt16000～30000（其中包括Hexon基因）发生了重组，表明Ningxia2020腺病毒基因组包含多个型内重组事件。与45株国内外代表株进一步分析显示，Ningxia2020株在nt14000～30000包含MF315028.1株的基因区域（其中包括Peton和Hexon基因区域），而Fiber基因区域为MK041236.1株的基因片段，在nt1～13000与45株代表株差异较大，提示该区域可能发生了重组，但来源未知，见图6。

图6 Ningxia2020株人腺病毒全基因组序列重组分析

3 讨论

2020年宁夏中卫市海原县患儿感染的腺病毒标本全基因组的G+C含量为55.22%，与人腺病毒C亚属其他病原G+C含量相似[16]。该标本与人腺病毒C亚属7个原始株同源性均＞90%，说明该患儿感染的病原很可能是人腺病毒C亚属。同源性分析结果显示，该标本与人腺病毒C亚属2型同源性最高（99.5%）。

Hexon基因位于晚期转录基因L3上，六邻体由五面体底座和三角形塔区组成，塔区有4个环状结构（Loop1～Loop4），Loop1上有6个高变区，Loop2上有1个高变区，这7个高变区有属特异性α抗原[17]，基于高变区，六邻体基因是腺病毒分类中最常用的基因。Hexon系统发育进化树显示，Ningxia2020标本与1953年美国分离得到的HAdV-C2原始株非常相似。Fiber基因位于晚期转录基因L5上，纤维蛋白结构包括球部、中轴和尾部3部分，纤突球部有型特异性抗原，是人腺病毒分型依据的主要区域[18]。基于Fiber构建的系统发育进化树提示，2020年宁夏咽拭子标本与HAdV-C104在同一支内。位于二十面体顶端的12个壳粒组成五邻体，每个五邻体包括基底部分和伸出表面的纤突，基底部分有属特异性β抗原[18]。Penton base进化树中，Ningxia2020标本与HAdV-C2原始株在不同分支，但和HAdV-C104原始株聚在一起。全基因组进化树结果显示，本研究标本与HAdV-C2原始株聚为一类。系统发育进化树的结果表明，Ningxia2020腺病毒可能发生了重组。进一步网状进化树分析结果表明，此株腺病毒与2012年11月从北京某医院患有支气管炎的患儿中分离到的毒株密切相关，具有相似的进化历史。

Simplot结果进一步证实了此株腺病毒是重组毒株，并且提示包含HAdV-C2、HAdV-C89和HAdV-C104多个型内重组。Hexon基因为HAdVC2，Penton和Fiber基因为HAdV-C104，与系统发育进化树的结果一致。与其余45株代表株的进一步分析表明，此株腺病毒五邻体和六邻体两个主要抗原蛋白基因区域均为human/CHN/BJ04/2012这株腺病毒基因，与网状进化树的结果相互印证。

婴幼儿群体对腺病毒的免疫水平较低[19]，是人腺病毒的易感人群。腺病毒占儿童呼吸道感染的比例高达15%[8]。儿童重症肺炎症状严重且预后不良，且目前只有对症治疗。人腺病毒C亚属是婴幼儿呼吸道感染的主要病原体之一，并且HAdV-C的频繁重组[16，20-21]可能改变致病力，因此需要加强腺病毒分子流行病学监测。

本研究是宁夏人腺病毒临床标本的首次全基因组进化报道，有助于了解宁夏人腺病毒的流行基因型，为腺病毒的预防控制提供科学依据，同时也进一步补充了我国流行HAdV-C的分子基础数据。