基于数据挖掘的PFKFB4在宫颈癌中的表达和基因调控网络研究

古彩茹，刘威，林梦园

1.广州市红十字会医院&暨南大学附属广州红十字会医院妇科，广东 广州 510220；2.广州市红十字会医院&暨南大学附属广州红十字会医院乳腺科，广东 广州 510220；3.深圳市人民医院妇科，广东 深圳 518020

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，在女性癌症患者中的发病率和死亡率均占第四位[1]。尽管早期筛查可降低宫颈癌患者的死亡率，但宫颈癌的浸润和转移仍然是死亡的主要原因[2]，也是影响患者生存率的主要因素[3]。针对这种恶性肿瘤，目前仍需更多分子标记物用于精准诊断和预后判断。因此，寻找宫颈癌早期诊断及预后判定新的生物标志物具有重要的临床价值。6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶4(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatases 4，PFKFB4)与癌细胞的代谢异常密切相关。有报道称，双功能酶PFKFB4在多种类型的癌症中高度表达，并且在乳腺癌、肺癌和前列腺癌中已证明其对肿瘤存活的重要作用[4-8]。但目前关于PFKFB4蛋白与宫颈癌的相关报道较少。本文选取PFKFB4基因作为研究目标，通过生物信息学数据库全面分析PFKFB4基因在宫颈癌中的表达和相关基因调控网络，为进一步研究PFKFB4在宫颈癌中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 Linked Omics分析 Linked Omics数据库(http://www.linkedomics.org/login.php)是一个基于网页的平台，可用于分析32个与TCGA癌症相关的多维数据集[9]。本研究通过Linked Omics研究TCGA数据库宫颈癌组织中的PFKFB4表达与患者肿瘤大小(T分期)、淋巴结转移(N分期)、远处转移(M分期)、年龄、种族和预后(总生存，overall survival，OS)等临床病理特征和预后的关系。利用Link Finder模块分析TCGA数据库宫颈癌队列中与PFKFB4相关的差异表达基因，根据Pearson相关系数分析在宫颈癌中与PFKFB4显著表达相关的基因，结果以火山图和热图显示。利用Link Finder模块Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)对差异相关基因进行GO[细胞成分(cellular component，CC)，生物过程(biological process，BP)和分子功能(molecular function，MF)]分析，KEGG信号通路分析激酶靶标富集，miRNA靶标富集和转录因子靶标富集。

1.2 c-BioPortal分析 cBioPortal是一种开放获取的网络分析数据资源，可用于多种癌症的基因组学数据的综合性探索，可用于探索基因的突变，拷贝数变异(CNV)和mRNA表达情况[10]。本研究使用c-Bio-Portal分析TCGA数据库中275例宫颈癌标本的PFKFB4基因变异频率和类型。

1.3 Gene MANIA分析 Gene MANIA在线数据库(http://www.genemania.org)是一个可用于构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)的网络平台，该平台可以根据基因组学和蛋白质组学数据进行识别和扩展指定基因功能相似的基因列表[11]。Gene MANIA还可以根据每个所选查询数据集的预测值进行权重评估。本研究采用Gene MANIA平台探讨PFKFB4可能存在相互作用的基因网络。

2 结果

2.1 宫颈癌中PFKFB4的表达与临床病理特征的关系 结果显示，PFKFB4的表达与宫颈癌的T分期、N分期和M分期显著相关(图1)。T期高(P<0.001)、有淋巴结转移(N1)(P=0.042)、伴有远处转移(M1)(P=0.047)者PFKFB4表达量高(图1A~1C)。PFKFB4在西班牙裔人群的宫颈癌组织中表达量显著高于非西班牙裔人群(P=0.047)，见图1D。PFKFB4在宫颈癌中的表达量还随着年龄的增高而逐渐增高(r=0.199，P<0.001)，见图1E。最后，PFKFB4的表达水平显著影响患者的OS，PFKFB4高表达组患者的中位生存时间为137.9个月，而低表达组的中位生存时间为110.3个月，PFKFB4高表达者的预后显著差于低表达患者(P=0.002)，见图1F。

图1 在宫颈癌中PFKFB4的表达与临床病理特征及预后的关系

2.2 宫颈癌中PFKFB4的相关性表达 为明确PFKFB4的潜在调控网络，通过Person相关性分析探讨与PFKFB4表达显著相关的基因(图1A)，结果提示PPFIA4、PDK1、P4HA1、SLC2A1、VEGFA是呈正相关差异最明显的前5个基因(图2B)，而SELP、ISCU、PLA1A、PGR和ALDH1A2是呈负相关差异最显著的前5个基因(图2C)。

图2 在宫颈癌中与PFKFB4相关的差异表达基因(Linked Omics)

2.3 宫颈癌中与PFKFB4表达相关的激酶、miRNA和转录因子网络 为进一步探索PFKFB4中PFKFB4的相关调控网络，通过GSEA分析发现多个与PFKFB4统计学相关的激酶、miRNA和转录因子。与PFKFB4表达相关最显著的前五个激酶分别是淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶LCK(lymphocyte-specific protein tyrosine kinase，LCK)、蛋白激酶N2(PKN2)、检查点蛋白激酶1(CHEK1)、激酶IJK和激酶MA2PK1。与PFKFB4表达相关最显著的前五个miRNA分别是miR-200a、miR-450、miR-18a、miR-423和miR-383。与PFKFB4相关最显著的前五个转录因子分别是HIF1、NFE2、ROAZ、AP1和MYOGNF1，见表1。

表1 宫颈癌中的激酶、miRNAs和转录因子靶向网络

2.4 GO功能注释和KEGG信号通路分析 在Linked Omics数据分析平台，对PFKFB4及其在宫颈癌中显著表达的相关基因进行基因富集分析(GESA)，其富集的生物学功能主要体现在蛋白结合、离子结合、核酸结合、水解酶活动、转移酶活动等(图3A)。通过KEGG信号通路富集分析发现，PFKFB4及显著相关基因在宫颈癌中主要参与了缺氧诱导因子HIF1信号通路，糖酵解/糖再生信号通路，果糖和甘露糖代谢通路等(图3B)。

2.5 宫颈癌中PFKFB4的基因组改变 通过cBioPortal分析TCGA数据库中275例宫颈癌的突变频率和类型，结果显示275名宫颈癌患者中只有1.8%的患者的PFKFB4发生了改变(图4)。这些改变包括：mRNA上调4例(1.45%)和突变1例(0.36%)。由此可见，在宫颈癌中，PFKFB4的基因突变发生率非常低。

2.6 PFKFB4的PPI蛋白互作网络 通过Gene-MANIA分析PFKFB4的PPI蛋白互作网络，结果提示PFKFB4与低氧诱导因子1α(HIF1A)，己糖激酶2(HK2)，6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶1/2/3(PFKFB1/2/3)，磷酸甘油酸变位酶1/2/4/5，赖氨酸羟化酶1(PLOD1)，线粒体融合蛋白(MFN1)等存在相互作用(图5)。

图5 PFKFB4的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络和功能分析

3 讨论

宫颈癌的治疗主要以手术、化疗和放疗为主，但是上述治疗之后仍存在复发和转移可能。目前，临床上迫切需要开发更多分子标记物用于宫颈癌的精准诊断和预后判断。癌细胞即使在氧气充足的情况下仍然通过糖酵解来代谢葡萄糖为其供能，靶向肿瘤的糖酵解被认为是一个潜在的治疗策略[12-13]。双功能酶PFKFB4是一个糖酵解的关键酶，大量研究提示PFKFB4与肿瘤的恶性进展密切相关[5，8，14-16]。但是，PFKFB4在宫颈癌中是否能作为预后判断的分子标记物尚不清楚。为了更深入地了解PFKFB4在宫颈癌中诊断和预后判断方面的价值，通过对公共测序数据进行生物信息学分析，研究PFKFB4的表达与宫颈癌临床病理特征及预后的关系，并探讨PFKFB4在宫颈癌中的相关调控网络。这项研究为PFKFB4在宫颈癌进展中的重要性及其作为宫颈癌潜在预后标志物提供了多层次的证据。研究结果表明PFKFB4的过表达对宫颈癌的生长侵袭、远处转移和患者生存结局中具有显著的影响。PFKFB4在宫颈癌中与几种肿瘤相关激酶(例如MK2PK1)、miRNA(例如miRNA-200a)和转录因子(例如HIF1)显著相关。这项研究基于生物信息学挖掘公共数据库中的宫颈癌测序数据，为后续研究PFKFB4在宫颈癌中的功能和机制奠定了初步基础。

本研究首先对PFKFB4在宫颈癌组织中表达与患者临床的病理特征进行了分析，发现PFKFB4的表达与患者更晚的TNM分期密切相关。PFKFB4在肿瘤越大的患者中表达量明显高于肿瘤较小的患者，在有淋巴结转移或远处转移的宫颈癌患者组织中的表达也显著高于无淋巴结转移或无远处转移的患者，这就提示PFKFB4与宫颈癌更具有侵袭性的临床病理特征是明确相关的，PFKFB4很有可能促进宫颈癌的进展。其次，PFKFB4的表达与患者的年龄相关，随着患者的年龄增长，PFKFB4的表达量也有升高趋势。另外，生存分析进一步明确PFKFB4的表达与患者的OS的关系，结果发现PFKFB4高表达的患者预后显著差于低表达的患者。这就表明PFKFB4可以作为宫颈癌的预后标记物，但是，仍需要多中心的研究进一步证实。

考虑到PFKFB4与患者预后的显著相关性，PFKFB4可能对宫颈癌的恶性进展发挥重要调控作用。本研究进一步探讨与PFKFB4在表达上存在统计学相关的基因。相关性分析提示PFKFB4与一些癌基因的表达呈正相关，比如影响癌症的增殖、侵袭、转移的关键调控因子丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)[17-18]，参与肿瘤血管形成促进肿瘤进展的血管内皮生长因子A(VEGFA)[19-20]，多种肿瘤的潜在标记物和治疗靶点脯氨酸-4-羟化酶α多肽Ⅰ(P4HA1)[21-22]等。这些结果进一步提示PFKFB4可能通过与其他癌基因相互作用共同促进宫颈癌的恶性进展。

本研究使用GSEA对PFKFB4进行富集分析获得了与其存在显著关联的多个激酶，miRNA和转录因子。结果表明，PFKFB4的功能网络主要参与代谢、生物调节、对刺激的反应和细胞增殖等。发现宫颈癌中的PFKFB4与包括MAP2K1、CHEK1和LCK在内的激酶网络相关。这些激酶可参与调节有丝分裂、DNA损伤和细胞内信号传导，这些通路异常与肿瘤的进展关系非常密切。此外，本研究还鉴定了几种与PFKFB4相关的miRNA。这些小RNA，可参与基因表达的转录后调控，进而影响肿瘤的进展。亦有其他研究证实miR-200a、miR-18a和miR-383可用作宫颈癌的诊断和预后标志物[23-25]。

这项研究使用基于生物信息学的在线工具对来自TCGA数据库的宫颈癌的组学数据进行靶基因分析，揭示了PFKFB4的潜在调控网络信息，为进一步研究PFKFB4在宫颈癌中的作用奠定基础。与传统的芯片筛选相比，该方法具有样本量大、成本低、操作简便的优点。这也使得大规模的宫颈癌的基因组学研究和后续功能研究成为可能。但是，本研究基于数据挖掘的分析结果仍需要得到更多的检测进行验证，包括功能检测和分子机制的研究，才能进一步明确PFKFB4在宫颈癌的调控作用。