亚硝酸盐降解芽孢杆菌的筛选鉴定及其降解效果研究

杨 程 徐 萍 文 芳 田丹丹 孙泽平

（黔南民族师范学院生物科学与农学院，贵州 都匀 558000）

0 引言

近些年，鱼类养殖等行业面临养殖水体的水质劣化、养殖物容易发生病害等问题，严重影响了行业的发展，并产生水体污染等问题。 利用一些具备特殊降解能力的微生物来降解水产养殖产生的污染物，净化水体，稳定水质是一种可行的解决办法[1，2]。 在实际生产中，很多微生物可以通过单一或复合制剂的形式应用在水产养殖过程中，从而对水质、底质问题有所改良。 其中，芽孢杆菌不仅具有一般微生态制剂的特性，还具有一系列的自身优势，例如，抗逆性强，稳定性高等，因此已经用于水产业中。 根据芽孢杆菌的生理特点以及在养殖过程中严格的要求，它在水产行业及水体生态治理方面具有较好的应用前景，值得深入挖掘其潜能[3-6]。

本研究从都匀市雨花湖底泥样品中用热处理和富集培养分离出芽孢杆菌，再通过试验指标筛选出降解NO2-有明显效果的菌株，并对筛选的菌株进行了鉴定。 实验证明筛选出的芽孢杆菌能有效降低水体中的NO2-含量，净化水质。

1 材料与方法

1.1 实验材料

从贵州省都匀市雨花湖公园附近，5～15 cm 深土层的土壤和不同水域的泥底中各取样10 个。 试验用的泥鳅购于江苏省连云港市赣榆区大学生生态渔场养殖基地。

1.2 试剂及仪器

用到的试剂主要有香柏油、KNO3、NaNO2、（NH4）2SO4、芽孢染色液（广东环凯029020）、琼脂粉、二甲苯、革兰氏染色液、蛋白胨。 设备主要有：恒温摇床、分光光度计、高压灭菌锅和超净台等。

1.3 模拟水样及培养基

模拟水样：LB 培养基稀释6.5 或60 倍备用。富集培养基：硝酸钾0.5 g，亚硝酸钠0.5 g，硫酸铵 1 g，葡萄糖2.5 g，泥鳅缸废水500 mL。 筛选培养基：硝酸钾1.5 mg，亚硝酸钠 3.75 mg，硫酸铵 3.125 mg，葡萄糖0.5 g，泥鳅缸废水500 mL。

1.4 产芽孢菌株的筛选和分离

在富集培养基中按照样品和培养基1∶5 接种样品，然后恒温培养24 小时左右。 将所得菌悬液放在预热好的80 ℃水浴中保温25 分钟后取出， 再用摇床120 r/min，30 ℃震荡培养约12 小时，将处理过的菌悬液按10-2、10-3的浓度梯度涂布在LB 固体培养基上，30℃静置培养20～36 小时。 待长出菌落后，挑选单个菌落进一步进行纯化，采用斜面传代保藏法和甘油冷冻法保存以待备用。

1.5 筛选具有降亚硝酸盐特性的菌株

纯培养得到的产芽孢菌用LB 液体培养基活化后稀释，取稀释后的菌液涂布在筛选培养基上，30℃培养24 小时后观察菌落，挑取其中最大的几个菌落，纯培养后保藏，以备后续实验。 所得菌株重复上述过程进行复筛。 最终得到一株降解亚硝酸盐效果明显的菌株，命名为Y2。

1.6 菌种鉴定

分离、 筛选得到的菌Y2 通过采用涂布平板的方法进行接种，30℃培养至长出菌落后， 观察菌落的形状、大小、颜色等特征且用常规的染色方法及革兰氏染色法、芽孢染色法进一步观察菌体的形态特征。 菌株进行 16S rDNA 测序（上海生工），通过 NCBI 网站中的 Blast 程序进行同源性比对，用MEGA-X 软件进行同源排列，构建系统进化树，推测Y2 的同源关系。

1.7 Y2 菌对模拟水样及泥鳅养殖水中亚硝酸盐的降解作用

稀释模拟水样6.5 倍后取样测定初始OD 值，28℃静置处理，设置2 个平行组和1 个空白对照，平行试验组每个三角瓶都投入浓度约为4.0×106cfu/mL 的等量菌液且每相隔48 小时取样测3 个模拟水样OD 值，用分光光度法根据亚硝酸盐国标检测标准测得出平行组与空白组中亚硝酸盐的含量， 实验组结果取2 个平行组的平均值[8]。 购回的泥鳅置于鱼缸中养殖大约一个星期，挑选大小及活跃度相近的45 条，随机平均分配在3个相同的鱼缸内，鱼缸内初始的水体相同。实验组中加入浓度约为3.0×106cfu/ml 的Y2 菌液，每日固定时间投喂等量的食物一次，每隔48 h 取样测3 个模拟水样OD 值，采样前的24 h 停止喂食，用分光光度法根据亚硝酸盐国标检测平行组与空白组亚硝酸盐的含量，实验组结果取2 个平行组的平均值。

2 实验结果

2.1 菌株分离、筛选与鉴定

将样品经过富集和热处理以后接种于固体平板，得到单菌落若干，挑选其中五株较大的单菌落培养保藏。 将这五株菌活化后进行初筛和复筛，最后获得生长速度较快，菌落较大的菌株一株，命名为Y2，将Y2菌株进一步确定为研究对象。 肉眼观察Y2 菌落为米黄色，菌落表面较光滑，如图1A。对Y2 芽孢染色，染色结果显示Y2 菌呈杆状，具有芽孢结构，其芽孢为椭圆且为中生，如图1B。对Y2 进行革兰氏染色显示Y2为革兰氏阳性菌。 对Y2 进行16S rDNA 测序并构建系统进化树分析，结果如图1D 所示。 由进化树可知，Y2 菌株和阿耶波多氏芽孢杆菌 （Bacillus aryabhattai B8W22） 的亲缘关系最近。 结合形态学的鉴定和16S rDNA 的分析结果可以基本确定出Y2 为阿耶波多氏芽孢杆菌。

图1

2.2 Y2 菌株对亚硝酸盐的降解

将Y2 菌株按一定浓度稀释后分别加入模拟水样和泥鳅养殖水样中， 测定Y2 对两类水体中亚硝酸盐的降解效果。 首先在模拟水样中亚硝酸盐浓度的测定结果如图2A 所示。在实验组加入4.0×106cfu/mL 浓度的Y2 菌液，实验组NO2-含量变化呈明显的下降，NO2-去除率为63.58%；作为对照的未加入Y2 组中NO2-含量则呈上升的趋势，上升率为17.35%；这一结果表面在模拟水样中加入Y2（Bacillus aryabhattai）可以有效地降低模拟水样中NO2-含量。 在泥鳅养殖水体中亚硝酸盐浓度变化结果如图2B 所示。 实验组中加入了浓度约为 3.0×106cfu/mL 的 Y2 菌液，NO2-含量在实验组中也有下降，NO2-去除率为24.3%； 而未加入Y2 的对照组中NO2-含量略微有上升趋势，上升率3.6%。 这一结果表明泥鳅养殖污水中加入Y2 菌后也可有效降低水中NO2-含量。

图2 模拟水样以及泥鳅养殖水样中NO2-含量随时间的变化

3 讨论与展望

本研究以人工湖泊和土壤为样品源，以其对亚硝酸盐的降解能力为主要参考指标筛选出1 株芽孢杆菌Y2，并根据其形态特征和分子鉴定，该菌被鉴定为阿氏芽孢杆菌。 通过对Y2 菌株在模拟水样及泥鳅养殖水体中亚硝酸盐含量的影响研究， 证明Y2 菌株可以有效的降低水体中亚硝酸盐的含量。

水体中NO2-浓度太高会对水体中的一些生物造成危害，对于水产养殖有较大的危害。 本研究分离的阿氏芽孢杆菌Y2 菌株在实验中显示出较好的亚硝酸盐去除效果，从而改善水质，因此本研究所分离的Y2菌株在净化水体，改善水产养殖水体水质方面具有一定的应用潜力和价值。 另外阿氏芽孢杆菌作为一种芽孢杆菌，生长条件要求不高、抗逆性极强，十分便于大规模的培养和应用在微生物制剂中。 很多研究表明，微生物制剂不仅能够有效地降低水产养殖过程中有害物质的很多不利影响，而且能有效改善水质[6，7]。 可以用来在水产养殖中应用益生菌改善养殖水体的质量、提高养殖物的生长力和免疫能力[8]。 在未来进一步的研究中可以深入研究Y2 菌株的这一潜力。