依托咪酯通过调控LncRNA CDKN2B-AS1/miR-199a-5p表达抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭

姜崇发 王秋红 刘建 李印玉 马增瑞 李治松

(1周口市中心医院麻醉科，河南 周口 466000；2牡丹江心血管病医院麻醉科；3广州前海人寿医院麻醉科；4宁夏回族自治区人民医院麻醉科；5郑州大学第一附属医院麻醉科)

麻醉药物可影响肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭等生物学行为，近年来，研究表明麻醉药物可有效提高胶质瘤治疗效果〔1〕。但胶质瘤发病机制尚未完全阐明，而放化疗可抑制肿瘤生长，但耐药性与放射抵抗性可降低治疗效果〔2〕。因而探索麻醉药物对胶质瘤发生发展的作用机制具有重要意义。研究表明依托咪酯可有效治疗宫颈癌及其他肿瘤，并可降低老年患者心血管风险〔3,4〕。依托咪酯还可抑制肺腺癌细胞的侵袭和迁移〔5〕。但依托咪酯对胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭的影响尚未可知。长链非编码RNA CDKN2B-AS1(LncRNA CDKN2B-AS1)在肝癌中高表达，敲低其表达可抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭，促进细胞凋亡〔6〕。但关于CDKN2B-AS1对胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭的影响尚未可知。starBase预测显示微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)可能是CDKN2B-AS1的靶基因，研究表明miR-199a-5p在胶质瘤细胞中呈低表达，miR-199a-5p过表达可抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭〔7〕。但胶质瘤发生过程中CDKN2B-AS1与miR-199a-5p是否存在靶向调控作用尚未可知。关于依托咪酯是否通过调控CDKN2B-AS1/miR-199a-5p的表达影响胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭尚未可知。本研究主要探讨依托咪酯对胶质瘤细胞恶性生物学行为的影响，初步分析其对CDKN2B-AS1/miR-199a-5p的调控作用机制及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1研究对象 2017年6月至2018年10月于周口布中心医院就诊的胶质瘤患者20例，所有患者经病理证实为脑胶质瘤，其中男11例，女9例，年龄50～70岁，平均(65.27±5.13)岁，肿瘤组织与癌旁组织切除后置于液氮中冻存，术后转移至-80℃超低温冰箱保存待测。

1.2材料与试剂 依托咪酯(依托咪酯)购自上海生工生物工程股份有限公司。胶质瘤细胞株U251购自美国ATCC公司。DMEM培养基与胰蛋白酶购自美国Thermo Fisher公司；磷酸盐缓冲液(PBS)、结晶紫溶液、蛋白提取试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；二喹啉甲酸(BCA) 蛋白定量检测试剂盒购自美国Sigma公司；CDKN2B-AS1小干扰RNA(si-CDKN2B-AS1)、乱序无意义阴性序列(si-NC)、miR-199a-5p模拟物(mimics)、阴性对照(miR-NC)均购自广州锐博生物科技有限公司；pcDNA3.1购自上海索宝生物科技有限公司；Lipofectamine2000购自上海润成生物科技有限公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自武汉艾美捷科技有限公司；Transwell小室与基质胶均购自美国BD公司；细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、p21一抗购自美国Cell Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3方法

1.3.1实验处理与分组 取对数生长期胶质瘤细胞U251，用不同浓度(0.5 μg/ml、1.0 μg/ml、2.0 μg/ml)的依托咪酯处理，随机分为Con组(未经任何处理的细胞)、依托咪酯0.5 μg/ml组(含有终浓度为0.5 μg/ml的依托咪酯培养液培养细胞24 h)、依托咪酯1.0 μg/ml组(含有终浓度为1.0 μg/ml的依托咪酯培养液培养细胞24 h)、依托咪酯2.0 μg/ml组(含有终浓度为2.0 μg/ml的依托咪酯培养液培养细胞24 h)〔8〕。采用MTT比色法检测各组细胞抑制率，选用作用效果最好的依托咪酯剂量组进行后续研究。后续实验中分别检测抑制CDKN2B-AS1表达与miR-199a-5p过表达对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响，实验分组为si-NC组(细胞中转染si-NC)、si-CDKN2B-AS1组(细胞中转染si-CDKN2B-AS1)、miR-NC组(细胞中转染miR-NC)、miR-199a-5p组(细胞中转染miR-199a-5p mimics)。为证实依托咪酯可通过调控CDKN2B-AS1/miR-199a-5p轴发挥作用，实验分组为依托咪酯+pcDNA组(细胞中转染pcDNA 48 h后使用含有终浓度为40 μmol/L的依托咪酯处理24 h)、依托咪酯+pcDNA-CDKN2B-AS1组(细胞中转染pcDNA-CDKN2B-AS1 48 h后使用含有终浓度为40 μmol/L的依托咪酯处理24 h)。

1.3.2实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞中CDKN2B-AS1、miR-199a-5p表达水平 采用Trizol法提取各组细胞总RNA，反转录合成cDNA，CDKN2B-AS1正向引物：5'-TGTACTTAACCACTGGACTACCTGCC-3'，反向引物：5'-CATTCTGATTCAACAGCAGAGATCAAAG-3'；GAPDH正向引物：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，反向引物：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'；miR-199a-5p正向引物：5'-TCAAGAGCAATAACGAAAAATGT-3'，反向引物：5'-GCTGTCAACGATACGCTACGT-3'；U6正向引物：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。参照试剂盒进行qRT-PCR，其中以cDNA为模板，反应条件：95℃ 2 min(循环1次)，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s(数字和摄氏度中间需要空格)(循环40次)。CDKN2B-AS1以GAPDH为内参，miR-199a-5p以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算CDKN2B-AS1、miR-199a-5p相对表达量。

1.3.3MTT比色法检测细胞增殖 取对数生长期U251细胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入DMEM培养液制备单细胞悬液接种于96孔板(3×104个细胞/孔)，培养24 h，按照“1.3.1”分组处理，每孔加入质量浓度为5 mg/ml的MTT溶液20 μl，室温孵育4 h，弃上清，加入DMSO(150 μl/孔)，匀速振荡10 min充分混匀，应用酶标仪检测波长为490 nm处各孔吸光度值(OD)，计算细胞抑制率，细胞抑制率=〔1-(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)〕×100%。

1.3.4Transwell实验检测细胞迁移与侵袭 细胞侵袭实验：培养液预先冻存，用预冷的培养液按照9∶1的比例稀释基质胶，基质胶稀释液平铺于Transwell小室上室的基底面，置于37℃恒温饱和湿度培养箱内孵育5 h。取对数生长期U251细胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入不含胎牛血清的培养液制备单细胞悬液接种于Transwell小室的上室(5×104个细胞/孔)；取600 μl含有10%胎牛血清的培养液置于Transwell小室的下室，放入37℃恒温饱和湿度培养箱内培养24 h，PBS洗涤，多聚甲醛固定10 min，0.1%结晶紫染液染色10 min，棉签擦掉未转移的细胞，显微镜下随机选取5个视野观察侵袭细胞数。细胞迁移实验：取对数生长期U251细胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入不含胎牛血清的培养液制备单细胞悬液接种于Transwell小室的上室(5×104个细胞/孔)，后续实验步骤同细胞侵袭实验，培养结束后显微镜下随机选取5个视野观察迁移细胞数。

1.3.5双荧光素酶报告基因检测 starBase预测 CDKN2B-AS1与miR-199a-5p存在结合位点，将结合位点及其突变位点分别插入荧光素酶报告基因载体构建野生型载体WT-CDKN2B-AS1与突变型载体MUT-CDKN2B-AS1，取对数生长期U251细胞，miR-199a-5p mimics分别与WT-CDKN2B-AS1、MUT-CDKN2B-AS1共转染至U251细胞，miR-NC分别与WT-CDKN2B-AS1、MUT-CDKN2B-AS1共转染至U251细胞，转染24 h后收集细胞，检测细胞荧光素酶活性。

1.3.6Western印迹检测CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表达 收集各组U251细胞，加入蛋白裂解液〔1 ml放射免疫沉淀试验(RIPA)、1%苯甲基磺酰氟(PMSF)、0.1% 抑肽酶〕提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，取30 μg蛋白上样量加入十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液，沸水中煮10 min蛋白变性，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，电泳反应条件：80 V 30 min，120 V 90 min(单位之间加空格)，根据marker位置切胶并应用湿转膜仪将蛋白凝胶转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入蛋白一抗稀释液(1∶1 000)，4℃孵育24 h，TBST洗涤，加入二抗(1∶2 000)，室温孵育1 h，TBST洗涤，滴加ECL，曝光显影，应用凝胶成像分析系统及ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.4统计学处理 采用SPSS21.0软件进行t检验、方差分析，LSD-t检验，Kruska-WallisH检验。

2 结 果

2.1LncRNA CDKN2B-AS1和miR-199a-5p在胶质瘤组织中的表达 与癌旁组织相比，胶质瘤组织中CDKN2B-AS1的表达水平显著升高(P<0.05)，而miR-199a-5p的表达水平显著降低(P<0.05)，见表1。

表1 CDKN2B-AS1和miR-199a-5p在胶质瘤组织中的表达

2.2依托咪酯对胶质瘤细胞U251中CDKN2B-AS1和miR-199a-5p表达的影响 与Con组相比，依托咪酯0.5 μg/ml组、依托咪酯1.0 μg/ml组、依托咪酯 2.0 μg/ml组胶质瘤细胞U251中CDKN2B-AS1的表达水平显著降低(P<0.05)，而miR-199a-5p的表达水平显著升高(P<0.05)，不同剂量组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 依托咪酯对胶质瘤细胞U251中CDKN2B-AS1和miR-199a-5p表达的影响

2.3依托咪酯对胶质瘤细胞U251增殖、迁移侵袭的影响 与Con组相比，依托咪酯0.5 μg/ml组、依托咪酯1.0 μg/ml组、依托咪酯 2.0 μg/ml组胶质瘤细胞U251抑制率显著升高，迁移与侵袭细胞数显著减少，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著降低，p21蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)，随着依托咪酯使用剂量的增加而显著变化(均P<0.05)，其中依托咪酯2.0 μmol/L时胶质瘤细胞U251抑制率显著高于其他剂量组(P<0.05)，迁移与侵袭细胞数显著少于其他剂量组(P<0.05)，因而选用依托咪酯2.0 μmol/L进行后续研究，见图1、表3、图2。

表3 依托咪酯对胶质瘤细胞U251增殖、迁移侵袭的影响

图1 胶质瘤细胞U251的迁移侵袭(结晶紫染色，×200)

1～4：Con组、依托咪酯0.5 μg/ml组、依托咪酯1.0 μg/ml组、依托咪酯2.0 μg/ml组图2 Western印迹检测增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

2.4抑制CDKN2B-AS1表达对胶质瘤细胞U251增殖、迁移侵袭的影响 与si-NC组相比，si-CD-KN2B-AS1组胶质瘤细胞U251抑制率显著增加(P<0.05)，迁移与侵袭细胞数显著减少(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，而p21蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，见图3、表4。

图3 Western印迹检测增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

表4 抑制CDKN2B-AS1表达对胶质瘤细胞U251增殖、迁移侵袭的影响

2.5miR-199a-5p过表达对胶质瘤细胞U251增殖、迁移侵袭的影响 与miR-NC组相比，miR-199a-5p组胶质瘤细胞U251抑制率显著增加(P<0.05)，迁移与侵袭细胞数显著减少(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，而p21蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，见图4、表5。

表5 miR-199a-5p过表达对胶质瘤细胞U251增殖、迁移侵袭的影响

图4 Western印迹检测增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

2.6CDKN2B-AS1靶向调控miR-199a-5p的表达 starBase预测显示CDKN2B-AS1的序列中含有与miR-199a-5p互补的核苷酸序列，见图5。双荧光素酶报告实验结果显示，双荧光素酶报告基因检测系统结果显示，miR-199a-5p组MUT-CDKN2B-AS1与miR-NC组比较，荧光素酶活性差异无显著性；miR-199a-5p组WT-CDKN2B-AS1与miR-NC组比较荧光素酶活性差异显著(P<0.001)，见表6。qRT-PCR检测结果显示，与si-NC组(1.00±0.09)相比，si-CDKN2B-AS1组胶质瘤细胞U251中miR-199a-5p的表达水平显著升高(2.26±0.23，P<0.05)；与pcDNA组(1.01±0.08)相比，pcDNA-CDKN2B-AS1组胶质瘤细胞U251中miR-199a-5p的表达水平显著降低(0.39±0.04，P<0.05)。

图5 CDKN2B-AS1的序列中含有与miR-199a-5p互补的核苷酸序列

表6 双荧光素酶报告实验

2.7CDKN2B-AS1过表达逆转了依托咪酯(2.0 μg/ml)对胶质瘤细胞U251增殖、迁移侵袭的作用 与依托咪酯+pcDNA组相比，依托咪酯+pcDNA-CDKN2B-AS1组胶质瘤细胞U251抑制率显著降低(P<0.05)，迁移与侵袭细胞数显著增加(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，p21蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，见图6、表7。

1～4:Con组，依托咪酯组，依托咪酯+pcDNA组，托托咪酯+pcDNA-CDKN2B-AS1组图6 Western印迹检测增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

表7 CDKN2B-AS1过表达逆转了依托咪酯对胶质瘤细胞U251增殖、迁移侵袭的作用

3 讨 论

脑胶质瘤是临床常见脑部恶性肿瘤之一，根据WHO标准可将脑胶质瘤分为低级别与高级别脑胶质瘤，由于早期诊断准确率较低导致患者错失最佳治疗时机，患者治疗后生存期较短〔9〕。因而深入分析影响胶质瘤迁移及侵袭的分子机制具有重要意义。LncRNA在肿瘤发生发展过程中发挥重要调控作用，研究表明其可作为竞争性内源RNA(ceRNA)靶向结合miRNA而间接调控下游靶基因表达从而促进或抑制胶质瘤迁移及侵袭〔10,11〕。

依托咪酯可通过下调(PI3K/Akt)信号通路的活性而抑制垂体瘤细胞的迁移〔12〕。研究报道指出依托咪酯是一种麻醉药物并可快速通过血脑屏障，研究表明镇静类麻醉药物可抑制多种肿瘤细胞转移及侵袭从而发挥抗肿瘤作用〔13,14〕。但依托咪酯对脑胶质瘤细胞恶性生物学行为的影响尚未可知。本研究结果说明依托咪酯可降低胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力。研究表明CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白与细胞增殖、迁移与侵袭能力密切相关，其中p21可通过抑制CyclinD1与CDK形成复合物而诱导细胞周期停滞于G0/G1期，抑制细胞增殖，MMP-2、MMP-9属于MMPs类，其在肿瘤中呈高表达并可增强细胞迁移及侵袭能力〔15,16〕。本研究结果提示依托咪酯可能通过抑制CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达及促进p21表达而减弱胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力。

CDKN2B-AS1可通过靶向miR-411-3p及调控HIF-1a/VEGF/P38途径而促进卵巢癌发生及发展〔17〕。干扰CDKN2B-AS1的表达可通过上调miR-181a-5p/TGFβI轴从而抑制宫颈癌细胞转移并促进细胞凋亡〔18〕。本研究结果提示抑制CDKN2B-AS1的表达可降低胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力。通过双荧光素酶报告实验证实CDKN2B-AS1可负向调控miR-199a-5p的活性，研究表明miR-199a-5p可通过下调ERK5的表达而抑制乳腺癌细胞侵袭〔19〕。Zhou等〔20〕研究表明miR-199a-5p通过靶向CCR7抑制膀胱癌细胞转移。与上述研究报道相似，本研究结果显示miR-199a-5p在胶质瘤组织中表达水平降低，miR-199a-5p过表达后可显著抑制胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭。本研究结果提示依托咪酯可通过下调CDKN2B-AS1的表达及上调miR-199a-5p的表达而抑制胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭。

综上，依托咪酯可抑制胶质瘤生长及转移，其作用机制主要是通过调控CDKN2B-AS1/miR-199a-5p的表达从而发挥作用，为临床合理用药及研发药物提供新方向，可为深入探讨吩噻嗪类药物对肿瘤的作用机制提供研究依据。