低温刺激下沙尘对大鼠肺组织损伤及作用机制

徐生刚 曹玉青 刘雨娟

(河西学院医学院，甘肃 张掖 734000)

沙尘天气是一种强灾害天气，尤其在冬春季节高发。研究表明，沙尘天气使呼吸系统疾病发病风险显著上升〔1〕。Grineski等〔2〕研究表明沙尘天气后1 d，儿童和青少年急性支气管炎入院风险为正常天气的1.33倍。兰州市一项研究表明，沙尘暴后3 d，兰州市呼吸系统疾病急诊入院人数增多14.0%〔3〕。当气温从某个临界值降低会增加呼吸系统疾病死亡率和发病率。研究显示，冬季气温每降低1℃，呼吸系统疾病死亡率就会增加3.3%〔4〕。Makinen等〔5〕研究表明气温每降低1℃，上呼吸道感染率增加4.3%，流感增加2.1%，咽炎增加2.8%，下呼吸道感染率增加2.1%。气温和大气颗粒物对呼吸系统疾病的影响表现为交互作用，低温能加剧大气中的颗粒物对呼吸系统的损害。Ren等〔6〕研究显示最低温每降低10℃，呼吸系统疾病入院率在PM10<20 μg/m3和>40 μg/m3时分别增加1.0%和7.3%〔6〕。尽管目前关于沙尘和低温对呼吸系统疾病影响的流行病学研究较多，但关于二者交互作用对呼吸系统损害的机制尚不明确。因此，本文探讨不同低温刺激下沙尘对大鼠肺组织的损害及作用机制，对治疗和预防由冷空气和沙尘导致的呼吸系统疾病有重要的意义。

1 材料与方法

1.1沙尘采集和处理 在2017和2018年3～4月，11～12月出现沙尘天气时，利用粉尘采样器和玻璃纤维滤膜，采集张掖市区室外空气中的沙尘颗粒。采样高度为5 m，每天采样24 h，采样流量为 100 L/min，连续采集。采集完成后的滤膜剪成约 1 cm×1 cm的方块，收集于干净的小烧杯内，使用去离子水将其完全浸没，利用超声波清洗仪振荡洗脱颗粒物，振荡3次，30 min/次。多层纱布过滤，收集滤液于离心管中，8 000 r/min离心15 min，收集下层沉淀物于培养皿内，真空冷冻干燥，颗粒物称重后低温避光保存待用。实验开始之前，用生理盐水将沙尘制成悬液并超声振荡高温高压灭菌。

1.2实验动物及分组 40只8周龄SPF级健康雄性 Wistar 大鼠购自甘肃省中医药大学实验动物中心。体重(180.41±10.33) g，将40 只大鼠按体重随机分成5组，每组8只。5组大鼠接受不同的处理，分别为：20℃+生理盐水组、20℃+沙尘组、10℃+沙尘组、0℃+沙尘组、-10℃+沙尘组。染尘染毒采用非暴露式气管滴注染毒法，大鼠用水合氯醛麻醉后固定，待大鼠呼吸平稳后，将事先预热的沙尘悬液注入大鼠气管内；1次/d，滴注量为1 ml/kg体重，连续3 d，每次间隔48 h，连续染毒3次。利用气候模拟箱(宁波乐电)模拟低温环境，每天持续低温刺激2 h。

1.3实验方法

1.3.1肺灌洗液提取 末次沙尘染毒结束后将所有大鼠处死，分离暴露气管，在气管上用剪刀剪一斜口，插入带有聚乙烯管的肺灌洗针头，结扎固定。缓慢注入生理盐水0.5 ml，然后用针管缓慢抽出灌洗液，边抽边轻轻按摩大鼠胸部。每只大鼠灌洗8次，记录每只大鼠灌洗液总量。提取的肺灌洗液立即放入冰箱4℃保存。

1.3.2肺泡灌洗液处理 将提取的灌洗液在4℃下，10 000 r/min离心20 min，吸取上清液用于乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、白蛋白(ALB)、白细胞介素(IL)-6、IL-8、C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平测定。

1.3.3肺组织匀浆制备 摘取右肺，并称重，利用匀浆器在冰浴中将其制成10%组织匀浆，于低温离心机4℃ 3 000 r/min 离心20 min，取上清液用于谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平测定。

1.3.4指标测定 测定试剂均由南京建成生物制品公司提供，严格按照试剂盒说明书测定各指标。

1.4统计学方法 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1不同低温刺激下沙尘对肺泡灌洗液炎性因子的影响 不同温度沙尘组肺泡灌洗液IL-6 、IL-8、CRP、TNF-α水平均显著高于20℃+生理盐水组(P<0.05)。0℃+沙尘组、-10℃+沙尘组肺泡灌洗液IL-6 、 IL-8、CRP、TNF-α水平均显著高于20℃+沙尘组和10℃+沙尘组(均P<0.05)，见表1。表明随着温度的降低，沙尘导致肺泡灌洗液IL-6 、IL-8、CRP、TNF-α 水平逐渐升高。

表1 不同低温刺激及沙尘作用下肺泡灌洗液中炎性因子水平比较

2.2不同低温刺激下沙尘对肺组织GSH-Px、SOD、MDA的影响 不同温度沙尘组肺组织GSH-Px、SOD水平均显著低于20℃+生理盐水组，MDA水平均显著高于20℃+生理盐水组(均P<0.05)。0℃+沙尘组、-10℃+沙尘组肺组织GSH-Px、SOD水平均显著低于20℃+沙尘组和10℃+沙尘组，MDA水平显著高于20℃+沙尘组和10℃+沙尘组(均P<0.05)，见表2。表明随着温度的降低，沙尘导致肺组织GSH-Px、SOD水平逐渐降低，MDA水平逐渐升高。

表2 不同低温刺激及沙尘作用下肺组织GSH-Px、SOD、MDA水平比较

2.3不同低温刺激下沙尘对肺泡灌洗液LDH、AKP、ACP 、ALB的影响 不同温度沙尘组肺泡灌洗液LDH、AKP、ACP 、ALB水平均显著高于20℃+生理盐水组(均P<0.05)。0℃+沙尘组、-10℃+沙尘组肺泡灌洗液LDH、AKP、ACP 、ALB水平均显著高于20℃+沙尘组和10℃+沙尘组(均P<0.05)，表明随着温度的降低，沙尘导致肺泡灌洗液LDH、AKP、ACP 、ALB水平逐渐升高。见表3。

表3 不同低温刺激及沙尘作用下肺灌洗液LDH、AKP、ACP、ALB水平比较

3 讨 论

沙尘天气发生时，空气当中不同粒径颗粒物的浓度明显升高〔7〕。低温刺激和大气颗粒物都可能导致呼吸系统疾病发病率和死亡率增加，且当低温和颗粒物同时存在影响更大。低温会导致呼吸道纤毛受损，受损的纤毛对颗粒物的清除作用减弱，从而导致更多颗粒物进入呼吸道，加重沙尘对呼吸系统的损伤。

Wang等〔8〕发现沙尘天气采集的PM2.5使支气管上皮细胞BEAS-2B IL-6、 IL-8水平上升。冷空气刺激促使肺细胞炎性因子IL-6、IL-8的表达增强〔9〕。本研究结果表明沙尘可诱发肺组织的炎症反应，低温刺激和沙尘的交互作用可使炎症介质增多，炎性反应增强，气温越低沙尘对呼吸系统损伤越严重。

研究表明沙尘中的PM2.5能够诱导肺组织发生氧化应激损伤〔10〕。研究发现大鼠暴露于PM2.5 7～14 d，肺组织中GSH-Px活性降低、MDA的含量明显升高〔11〕。本研究结果表明沙尘会造成肺组织氧化损伤，低温会加重沙尘对肺组织氧化损伤，气温越低氧化损伤越重。

LDH是胞质酶，ACP 是溶酶体酶，当细胞膜受损或细胞死亡溶解后会大量释出；ALB反映肺泡上皮毛细血管屏障损伤程度；AKP活性提示肺泡Ⅱ型细胞受损程度。本研究结果表明气温越低，沙尘对肺组织细胞的毒性作用越强，低温会加重沙尘对肺组织细胞的毒性损伤。

综上，低温刺激可能会增加沙尘对呼吸系统的损伤，其主要机制是低温刺激会增强沙尘颗粒物对肺组织的炎症反应、氧化应激损伤和细胞毒性作用，温度越低炎症反应越重、氧化应激损伤和细胞毒性作用越强，对肺组织的损害越大。