HPLC法测定水合羟基化头孢克洛杂质研究

刘萍 胡利敏 田洪年 李敏 张文胜 杨梦德 贾全 孙玉双

(华北制药河北华民药业有限责任公司，石家庄 052165)

头孢克洛(cefaclor)是第二代口服头抱菌素衍生物，是EliLilly公司在1975年报道的新药[1]，是广泛应用于抗感染的头孢菌素类抗生素药物。头孢克洛抗菌谱主要是：葡萄球菌、肺炎双球菌、大肠埃希菌等，其作用机制为使转肽酶失活，干扰细菌细胞壁的合成，阻止黏肽原的交联[2]。头孢克洛杂质包括合成过程中产生的工艺杂质以及在酸、碱、高温和光照条件下产生的降解杂质[3-4]。头孢克洛在高温和强光条件下均会降解产生羟基化降解物杂质。头孢克洛和水合羟基化头孢克洛杂质结构式见图1。水合羟基化头孢克洛杂质的化学名为(6R, 7R)-7-(R)-2-氨基-2-苯乙酰氨基)-3-氯-2-羟基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-3-烯-2-羧酸。水合羟基化头孢克洛杂质未被《欧洲药典》10.0版(EP10.0)[5]收载在头孢克洛原料药项下。《中国药典》2020版收载了头孢克洛原料药的有关物质测定方法，未对各杂质进行单独控制，未对水合羟基化头孢克洛杂质准确定性定量研究，参照《中国药典》2020版头孢克洛原料药等[6-7]有关物质方法对该杂质进行测定，并对该方法进行方法学考察，同时采用加校正因子的主成分自身对照法和外标法对该杂质进行定量研究。试验证明该方法操作简便、准确度高、重现性好，可以采用不加校正因子的主成分自身对照法进行定量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪(DAD检测器、美国Agilent公司)；XS105电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；FE20 pH计(瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.2 试药

头孢克洛对照品(中国食品药品检定研究院，批号130418-201606，含量94.4%)；水合羟基化头孢克洛杂质对照品(广州牌牌生物科技有限公司，批号PITBKL-2-20190112-03，含量95.17%)；头孢克洛原料药(华北制药河北华民药业有限责任公司，批号D1121903002)；磷酸二氢钠、磷酸为分析纯，乙腈为色谱纯，水为纯化水。

2 色谱条件

2.1 检测波长的选择

取水合羟基化头孢克洛杂质对照品用0.27%磷酸二氢钠溶液(pH2.5)溶解并稀释制成0.1 mg/mL的溶液，在190～400 nm范围紫外扫描，见图2。谱图显示，水合羟基化头孢克洛杂质在220 nm处有最大吸收，与《中国药典》2020版收载的头孢克洛原料药的有关物质测定方法中检测波长一致。

2.2 色谱条件

参照《中国药典》2020版收载的头孢克洛原料药的有关物质测定方法。色谱柱：资生堂CAPCELL PAK AQ C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相A为0.78%磷酸二氢钠溶液(取磷酸二氢钠7.8 g，加水溶解并稀释至1000 mL，用磷酸调pH至4.0)，流动相B为0.78%磷酸二氢钠溶液(pH4.0)-乙腈(55:45)；流速1.2 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：25℃；进样量20 μL；按表1进行线性梯度洗脱。

表1 梯度洗脱时间表Tab.1 Gradient elution schedule

2.3 溶液配制

2.3.1 对照品溶液

精密称取水合羟基化头孢克洛杂质对照品6 mg，置于50 mL量瓶，加0.27%磷酸二氢钠溶液(pH2.5)溶解并稀释至刻度，摇匀。

2.3.2 供试品溶液

取头孢克原料药约50 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加0.27%磷酸二氢钠溶液(pH2.5)溶解并稀释至刻度，摇匀。

2.3.3 系统适用性溶液

取供试品约50 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，精密量取对照品溶液1.5 mL置上述量瓶中溶解再加0.27%磷酸二氢钠溶液(pH2.5)溶解并稀释至刻度，摇匀。

2.4 系统适用性试验

精密量取系统适用性溶液20 μL，进样检测，记录色谱图。结果见图3，头孢克洛与水合羟基化头孢克洛杂质分离度为4.67，大于1.5，证明该方法系统适用性良好。

3 校正因子的测定

3.1 杂质峰定位

取“2.3.3”项下系统适用性溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，确定水合羟基化头孢克洛杂质的保留时间，计算该杂质相对于主成分头孢克洛的相对保留时间(RRT=t杂质/t头孢克洛)，结果为1.11，见图3。

3.2 杂质校正因子的测定

3.2.1 重复性试验

精密称取头孢克洛对照品和水合羟基化头孢克洛杂质对照品适量，用0.27%磷酸二氢钠溶液(pH2.5)溶解并稀释制得浓度分别为定量限、0.010、0.020、0.025、0.030和0.035 mg/mL的系列标准溶液，分别进样，按“2.2”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。以对照品溶液浓度C为横坐标，色谱峰面积A为纵坐标，进行线性回归。

分别配制3组头孢克洛、水合羟基化头孢克洛杂质线性浓度，绘制标准曲线，计算线性回归方程，头孢克洛与杂质回归方程式斜率之比即为校正因子，并计算校正因子的RSD值。

头孢克洛和水合羟基化头孢克洛杂质线性重复性结果见表2，水合羟基化头孢克洛杂质校正因子计算重复性结果见表3。

表2 线性重复性结果Tab.2 Linear repeatable result

表3 校正因子计算重复性结果Tab.3 Correction factor calculation repeatability results

3.2.2 中间精密度试验

不同人员在不同日期使用不同的仪器，分别配制3组头孢克洛、水合羟基化头孢克洛杂质线性曲线，通过计算头孢克洛与水合羟基化头孢克洛杂质回归方程式斜率之比，求得水合羟基化头孢克洛杂质的校正因子，并计算校正因子的RSD值。具体试验过程同“3.2.1”项。

头孢克洛和水合羟基化头孢克洛杂质线性中间精密度结果见表4，水合羟基化头孢克洛杂质校正因子计算中间精密度结果见表5。

表4 线性中间精密度结果Tab.4 Linear intermediate precision results

表5 校正因子计算中间精密度结果Tab.5 Correction factor to calculate intermediate precision results

结果表明：重复性和中间精密度中9个校正因子的RSD均小于5.0%；中间精密度与重复性数据比较，计算出水合羟基化头孢克洛杂质校正因子的18个数的RSD为0.53%，小于5.0%，说明该方法测定水合羟基化头孢克洛杂质校正因子中间精密度良好。水合羟基化头孢克洛杂质校正因子为1.02。

4 方法学考察

4.1 专属性试验

以0.27%磷酸二氢钠溶液(pH2.5)为溶剂，按“2.2”项下色谱条件进样检测，记录色谱图。在头孢克洛和水合羟基化头孢克洛杂质处均无色谱峰出现，表明溶剂无干扰(图略)。

4.2 检测限和定量限

精密量取对照品溶液逐级稀释，按“2.2”项下色谱条件进样测定，结果水合羟基化头孢克洛杂质的检测限(S/N=3.5)为5.5594ng，相当于供试品溶液浓度(5 mg/mL)的0.05559‰；定量限(S/N=10.5)为17.721ng，相当于供试品溶液浓度(5 mg/mL)的0.1772‰。取定量限溶液重复进样6次，主峰峰面积的RSD为3.47%，主峰保留时间的RSD为0.16%。

4.3 线性试验

具体试验过程见“3.2.1”项。水合羟基化头孢克洛杂质的回归方程为A=22012.3009c-0.9319。结果表明，水合羟基化头孢克洛杂质在9.108×10-4～3.400×10-2mg/mL范围内线性关系良好(r=1.0000)。

4.4 回收率试验

4.4.1 试验过程

精密量取“2.3.1”项下对照品溶液5 mL，置25 mL量瓶中，用0.27%磷酸二氢钠溶液(pH2.5)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为外标法对照品溶液。

按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液。

精密量取“2.3.1”项下供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用0.27%磷酸二氢钠溶液(pH2.5)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为1%对照品溶液。

精密称取头孢克洛原料药(批号D1120903002，水合羟基化头孢克洛杂质含量为0)约50 mg，共9份，分别置10 mL量瓶中，平均分成3组，每组分别加入“2.3.1”项下对照品溶液1.6、2.0和2.4 mL，用0.27%磷酸二氢钠溶液(pH2.5)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为回收率溶液。

分别精密量取外标法对照品溶液、供试品溶液、1%对照品溶液和回收率溶液各20 µL注入液相色谱仪，按“2.2”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。以外标法计算加入水合羟基化头孢克洛杂质的回收率，同时分别采用外标法与加校正因子的主成分自身对照法对加入的水合羟基化头孢克洛杂质的含量进行计算并比较结果。

4.4.2 试验结果

以外标法计算加入水合羟基化头孢克洛杂质的回收率，结果见表6，水合羟基化头孢克洛杂质的平均回收率(n=9)为104.03%，RSD为0.82%。

表6 回收率试验结果Tab.6 The results of sample recovery rate test

分别采用外标法与加校正因子的主成分自身对照法对加入的水合羟基化头孢克洛杂质的量进行计算，结果见表7。

表7 外标法与校正因子法结果比较Tab.7 Comparison of the results of external standard method and correction factor method

4.5 溶液稳定性考察

精密量取“2.3.1”项下对照品溶液5 mL，置25 mL量瓶中，用0.27%磷酸二氢钠溶液(pH2.5)溶解并稀释至刻度，摇匀，分别在4℃条件下放置0、1、2、4、6、8、10、12和24h进样测定，对照品峰面积的RSD为0.23%。表明水合羟基化头孢克洛杂质对照品溶液在24h内稳定，结果见表8。

表8 溶液稳定性试验结果Tab.8 The results of solution stability test

4.6 耐用性考察

由于供试品中水合羟基化头孢克洛杂质未检出，为了更准确的测定水合羟基化头孢克洛杂质，使用加标供试品溶液进行试验。通过改变检测波长(215、220和225 nm)、柱温(20、25和30℃)、流速(1.0、1.2和1.4 mL/min)、流动相B中磷酸盐与乙腈比例(50:50、55:45和60:40，V/V)、流动相A的pH值(3.8、4.0和4.2)，以及使用不同品牌的色谱柱(资生堂 CAPCELL PAK C18AQ色谱柱，4.6 mm×250 mm， 5 μm；Waters Sun fire®C18色谱柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；岛津ODS-SP色谱柱，4.6 mm×250 mm，5 μm)来考察分析方法的耐用性。

4.6.1 试验过程

按“4.4.1”项下配制外标法对照品溶液。

精密量取“2.3.1”项下对照品溶液4.5 mL，置100 mL量瓶中，用0.27%磷酸二氢钠溶液(pH2.5)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为稀释剂。

精密称取头孢克洛原料药约50 mg，置10 mL量瓶中，加入稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为加标供试品溶液。

精密量取加标供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用0.27%磷酸二氢钠溶液(pH2.5)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为1%对照品溶液。

分别精密量取外标法对照品溶液、加标供试品溶液、1%对照品溶液各20 µL注入液相色谱仪，按“2.2”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。分别采用外标法与加校正因子的主成分自身对照法计算加标供试品中水合羟基化头孢克洛杂质的含量。

4.6.2 试验结果

经试验，以上色谱条件变化均能满足系统适用性试验的要求，对供试品中水合羟基化头孢克洛杂质的含量测定影响较小，采用外标法与加校正因子的主成分自身对照法计算加标供试品中水合羟基化头孢克洛杂质含量的结果一致，水合羟基化头孢克洛杂质的校正因子的耐用性考察见表9～11。水合羟基化头孢克洛杂质相对保留时间1.10～1.12，且保持稳定，水合羟基化头孢克洛杂质的相对保留时间耐用性考察见表12。

表9 校正因子的耐用性考察-检测波长和柱温Tab.9 The correction factor of durability test-detection wavelength and column temperature

表10 校正因子的耐用性考察-流速和流动相A的pH值Tab.10 The correction factor of durability test- flow and pH of the mobile phase A

表11 校正因子的耐用性考察-流动相B中磷酸盐与乙腈比例和色谱柱Tab.11 The correction factor of durability test- the ratio of phosphate to acetonitrile in mobile phase B and column

表12 相对保留时间的耐用性考察Tab.12 Relative retention time of durability test

5 讨论

5.1 校正因子的确定

本研究通过中间精密度6条曲线，共得出18个校正因子的平均值，确定水合羟基化头孢克洛杂质的校正因子为1.02。在准确度以及耐用性考察中，将加校正因子的主成分自身对照法和外标法的结果对比，佐证了校正因子的准确性，同时在耐用性试验中，对该杂质的相对保留时间进行考察，确定该杂质的相对保留时间稳定。

参考ICH关于化药质量标准中校正因子的指导原则，校正因子在0.9～1.1时，可采用不加校正因子的主成分自身对照法计算含量。本研究中水合羟基化头孢克洛杂质可不予校正。

5.2 水合羟基化头孢克洛杂质的控制

水合羟基化头孢克洛杂质在高温、强光条件下均会降解产生，在稳定性放置过程中也会降解产生，在头孢克洛原料药稳定性放置过程中含量会增加到0.3%左右。头孢克洛原料药的质量标准中可以增加对该杂质的单独控制，采用相对保留时间定位，采用不加校正因子的主成分自身对照法定量研究，以确保原料药的安全有效。