黄连解毒汤通过抑制TGF-β信号通路减轻2型糖尿病大鼠肝脂肪变性和纤维化研究

苟 芳 ,张红军 ,王 洁 ,张邱兵

(1.广元市中心医院,四川 广元 628000； 2.西南医科大学附属医院,四川 泸州 646000)

高血糖可引起糖原在肝脏堆积及肝脏微血管病变，损害肝功能，严重者可导致肝纤维化和肝硬化[1]。越来越多的证据表明，2型糖尿病(Type 2 diabetes，T2DM)患者罹患非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的风险明显升高[2]。更有研究者认为，糖尿病是促进肝脏疾病进展和肝脏相关病死率的独立危险因素[3]。进行性脂肪沉积和肝纤维化是NAFLD的典型特征,除胰岛素抵抗和高胰岛素血症外，肝脏中的脂质代谢紊乱、氧化应激及炎症反应导致T2DM和NAFLD的进展，并促进肝脏纤维化和潜在的肝硬化[4]。在肝损伤及纤维化过程中，转化生长因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)/Smad信号通路起重要作用[5-6]。黄连解毒汤为中药清热剂，具有清热解毒之功效，主治三焦火毒证[7-8]。以往的药理研究表明[9]，黄连解毒汤在临床治疗和实验研究中对肺炎、泌尿系感染、流行性脑脊髓膜炎、发热等具有一系列有益作用。最新的研究表明[10]，黄连解毒汤对糖尿病及其并发症，如心血管疾病和糖尿病肾病也有作用。然而，其对T2DM时肝损伤的影响及其机制尚不清楚。因此，本研究中，我们探讨了黄连解毒汤对2型糖尿病大鼠肝脏损伤的影响，以期为临床合理用药提供更多依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与干预 30只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠150～170 g，购于成都达硕实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(川)2020-030。饲养环境为SPF环境，温度22～25 ℃，湿度60%～70%，12 h/12 h明暗周期。黄连解毒汤由我院药剂科制备。所有动物实验均符合动物护理委员会制定的指导方针。适应性喂养1周后，将30只大鼠随机分为对照组(NC组,n=10)和实验组(n=20)，造模前12 h禁食，实验组大鼠按照55 mg/kg 剂量的链脲佐霉素(Streptozocin，STZ)进行腹腔注射，用高脂高糖饲料(标准饲料中添加10%蔗糖、10%猪油硬脂、2%胆固醇和0.5%胆酸)喂养6周；NC组给予相同剂量的柠檬酸钠缓冲液，喂养标准饲料6周。STZ注射7 d后，测空腹血糖，实验组以血糖水平13.5～25 mmol/L为造模成功标准。 再将实验组大鼠随机分为糖尿病模型组(DM组,n=10)：给予同等量0.9%氯化钠溶液灌胃；黄连解毒汤组(HL组,n=10)：按照2.44 g/(kg·d)标准，给予黄连解毒汤灌胃，连续4周。黄连解毒汤的剂量根据人临床剂量换算，换算公式：大鼠剂量(g/kg)=9.1×人临床剂量(0.067 g/kg)。

1.2 实验方法

1.2.1 采血和组织制备：治疗结束时，大鼠在隔夜禁食后被处死，经大鼠眶后静脉丛采血，用全自动生化分析仪检测甘油三酯(Triglyceride，TG)、总胆固醇(Total cholesterol，TCHO)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)、丙氨酸转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)等肝功能指标。肝脂酶活性测定参照南京建成生物科技有限公司商品化试剂盒的说明进行。用ABTS试剂盒测定肝组织总抗氧化能力，并按碧云天生物技术有限公司(中国)试剂盒说明检测肝脏过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性。将大鼠肝组织与过量的H2O2混合3 min后，检测剩余的H2O2，并以每分钟H2O2转化为水和氧的量来测定CAT活性。用南京建成生物科技有限公司商品化试剂盒检测血清丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)等氧化应激特异性标志物。8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHDG)的血清水平根据制造商的说明使用商用试剂盒(中国武汉)进行评估。肝标本用10%中性甲醛固定，然后用梯度乙醇脱水，石蜡包埋进行组织学检查。

1.2.2 组织病理学检查：固定和处理后的肝脏石蜡切片(4 μm)按说明书中的标准步骤分别用苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)试剂、Masson三色试剂和油红O染色。其他石蜡固定的肝标本切成6 μm厚的切片，用苦味酸-天狼星红(0.1%天狼星红在饱和的苦味酸水溶液中)(Sigma，美国)染色以检测肝纤维化，主要以Ⅰ型和Ⅲ型胶原为观察值班。切片在显微镜下成像，每层随机选取5幅图像，用Image J软件分析阳性区域的光密度。

1.2.3 免疫组化染色：切片用二甲苯脱蜡，乙醇脱水。抗原修复在95 ℃柠檬酸盐水中微波3 min，然后用3%过氧化氢处理25 min。用5%牛血清白蛋白封闭后，与兔抗α平滑肌肌动蛋白(Alpha smooth muscle actin，α-SMA)抗体或兔抗转化生长因子CD681抗体(稀释1∶1000)、3-硝基酪氨酸(3-NT)抗体(稀释1∶500)4 ℃孵育过夜。切片与辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP)标记的羊抗兔IgG(中国武汉达科)室温孵育50 min。用DAB染色观察α-SMA、CD68的表达。然后在光学显微镜下检查切片。随机选择5个图像进行数字采集(放大400倍)，并用Image J(NIH，Bethesda，MD)软件对光密度进行量化。

1.2.4 PCR检测：参照操作说明书提取组织标本中的总RNA，将RNA反转录成cDNA，再扩增成DNA，所有步骤严格按照逆转录试剂盒和扩增试剂盒说明书操作。引物序列见表1，所有引物序列均由上海生物工程技术有限公司合成。RT-PCR反应条件如下：95 ℃预变性10 min，然后95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，40个循环，最后70 ℃延伸10 min结束。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot检测：肝组织匀浆在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冷RIPA缓冲液中。裂解产物经SDS-PAGE电泳，然后转移到聚偏氟乙烯(Polyvinyllidene fluoride，PVDF)膜上。封闭后，免疫印迹分别与兔甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体(稀释1∶1000)、兔核转录因子-κB (Nuclear transcription factor-κB，NF-κB)(稀释1∶1000)抗体、兔TGF-β(稀释1∶2000)抗体、兔Smad2/Smad3(稀释1∶2000)抗体、兔Ⅰ型胶原抗体(稀释1∶1000)孵育过夜，再用二抗山羊抗兔HRP(北京康明生物科技公司)进行孵育。使用Chemi Doc-it 510成像系统进行扫描和可视化。通过Quantity One软件分析条带强度。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 黄连解毒汤对糖尿病大鼠一般情况的影响 见表2。与NC组大鼠相比，DM组大鼠的体重增长量较小，但食物和水的摄入量明显增加。HL组大鼠治疗后大鼠的体重增长量有所增加，并改善了糖尿病大鼠的多饮和多食。同时，经HL治疗后，大鼠的空腹血糖水平降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 黄连解毒汤对糖尿病大鼠一般情况的影响

2.2 黄连解毒汤改善糖尿病大鼠肝脏形态和功能的影响 见表3(图1)。与NC组相比，DM组大鼠肝脏肥大，肝指数及ALT、AST水平明显升高，而HL组大鼠肝指数明显降低，血清ALT、AST水平均明显降低。HE染色结果显示，与NC组相比，DM组肝小叶损害严重，门脉周围及间质纤维结缔组织增多。中央静脉周围有大量肝细胞脂肪变性。HL组大鼠肝小叶结构相对完整，肝细胞组织化程度高，炎性细胞浸润少，HL治疗后明显减轻了糖尿病肝脂肪变性的形态学改变。

表3 黄连解毒汤对糖尿病大鼠肝功能的影响

2.3 黄连解毒汤对糖尿病大鼠肝脏脂代谢紊乱及脂质沉积的调节作用 见表4(图2)。DM组大鼠血清TG、TCHO和LDL水平明显高于NC组，而HDL明显较低，经HL干预后可有效改善糖尿病大鼠脂代谢紊乱。油红O染色检测显示，DM组大鼠肝内有大量脂质沉积。大量脂肪变性肝细胞在中央静脉周围呈斑点状分布，病变较重。HL干预后在很大程度上改变了这种脂质分布，中央静脉周围有较轻的脂肪变性肝细胞聚集。

图2 黄连解毒汤对糖尿病大鼠肝脏脂质沉积的影响

2.4 黄连解毒汤抗肝纤维化的作用 Masson染色结果显示，糖尿病大鼠肝组织中结缔组织明显增生，细胞外基质(ECM)含量增加。小叶周围胶原堆积，形成大的纤维间隔和假小叶。然而，在HL治疗组的肝脏中这些病变明显减轻。α-SMA免疫组化染色显示，DM组α-SMA阳性细胞明显增多，分布于汇管区、纤维间隙。与DM组比较，HL组α-SMA表达降低。进一步进行天狼星红染色发现，DM组的Ⅰ型和Ⅲ型胶原水平明显高于NC组，而HL治疗的糖尿病大鼠肝脏的Ⅰ型和Ⅲ型胶原水平明显降低(图3)。

图3 黄连解毒汤抗肝纤维化的作用

2.5 黄连解毒汤对肝脏糖代谢相关基因表达的影响 见表5。与DM组相比，HL治疗有效地降低了糖异生关键酶Pck1和G6P基因的表达水平。与NC组大鼠相比，成脂关键基因如固醇调节元件结合蛋白1c(Srebp1c)和硬脂酰辅酶A去饱和酶1(Scd1)显著上调，而β氧化关键基因，如过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶2(ACOX2)和肉碱棕榈酰转移酶1(Cpt1)基因表达下调，提示HL可显著降低糖尿病大鼠肝脏成脂基因的表达，但对β-氧化作用影响不大。这表明，HL可预防肝脏脂肪变性，有效改善糖尿病大鼠肝脏糖代谢，减少新生脂肪生成。

表5 黄连解毒汤对肝脏糖代谢相关基因表达的影响

2.6 黄连解毒汤对糖尿病肝组织炎性反应及信号通路的影响 见图4、5(表6)。CD68免疫组化染色显示，DM组大鼠肝脏巨噬细胞浸润明显增加，而HL干预可抑制这一过程。Western blot检测显示，DM组大鼠肝脏组织中p-NF-κB、TGF-β及p-Smad2/3表达水平明显增高，差异有统计学意义(均P<0.05)。经HL干预后，大鼠肝脏组织中p-NF-κB、TGF-β及p-Smad2/3表达水平明显降低，差异有统计学意义(均P<0.05)。

图4 黄连解毒汤对糖尿病肝组织炎性反应及信号通路的影响

图5 黄连解毒汤对糖尿病肝组织信号通路蛋白表达的影响

表6 黄连解毒汤对肝脏组织中p-NF-κB、TGF-β及Smad2/3蛋白表达的影响

3 讨 论

肝脏是脂肪生成、糖异生和胆固醇代谢的中心器官，T2DM患者的肝脏脂肪变性是游离脂肪酸摄取、合成、输出和氧化失衡的结果[11]。在本研究过程中发现，黄连解毒汤具有稳定的降血糖作用。同时也发现，黄连解毒汤对肝脏中糖异生酶如Pck1和G6P的基因表达也有一定影响。在2型糖尿病中，胰岛素抵抗会导致外周脂肪细胞发生脂解，形成游离脂肪酸释放到血液中，并最终在肝脏中积累。通过油O红染色，我们发现黄连解毒汤显著减少了肝脏中积累的脂肪。黄连解毒汤调节脂质代谢紊乱的作用与抑制脂肪生成有关，Scd1基因表达下调证明了这一点。此外，Srebp1c已被确认为胰岛素和葡萄糖对糖酵解和脂肪生成基因表达的转录效应的中介[12]。在本研究中，黄连解毒汤对Srebp1c的表达也有抑制作用。肝脂酶是与血清甘油三酯水平相关的关键酶，肝脂酶的降低会导致脂质清除障碍，从而导致外周血中甘油三酯的积累。

糖尿病环境下的脂质代谢紊乱，如TCHO、TG和LDL增加，以及肝脏中大量沉积的脂质，将导致失衡的氧化应激反应。根据著名的“两次打击”假说，炎症会进一步触发结构和功能损害[13]。本研究发现，大鼠肝脏中氧化应激明显增强，经过干预后发现，黄连解毒汤对肝脏脂质堆积有明显的抑制作用。此外，它还减少了随后MDA的积累，防止进一步的DNA氧化损伤，并提高糖尿病肝脏的抗氧化能力。肝细胞中的脂质过载促进氧化应激的加剧，氧化应激通过释放白介素和单核细胞趋化蛋白促进炎症状态，随后，巨噬细胞浸润活化，促进促炎细胞因子的进一步释放[14]。在本研究中，我们通过验证巨噬细胞标志物CD68的升高来证实糖尿病肝脏炎症的增加。先前研究也表明黄连解毒汤的体外抗炎作用[15]。在目前的研究中，这种抗炎作用主要体现在减少巨噬细胞的浸润。炎症小体的激活是启动炎症的重要机制，NF-κB可通过激活信号通路和TLR来促进炎性小体成分的转录，在调节炎症应激中起着关键作用[16]。有研究者报道称[17]，肥胖和高脂饮食会导致肝脏中NF-κB活性显著升高，在我们的研究中也观察到了这一点。经黄连解毒汤干预后，显著下调了糖尿病大鼠肝组织中NF-κB的大量活化，这可能是其抑制糖尿病肝脏炎症的机制之一。

肝纤维化是慢性肝损伤的常见结果，其特征是细胞外基质蛋白的异常沉积[18]。在本研究中，天狼星红染色和Masson染色显示糖尿病大鼠的胶原蛋白明显增加。这主要是由于慢性高血糖和肝脏中的脂质紊乱通过炎症和氧化应激造成的伤害。糖尿病不仅会加速肝脏炎症，导致更严重的肝功能衰竭，而且可能会增加细菌感染的发生率。炎症细胞因子在纤维化中起关键作用。因此，糖尿病条件下的持续性炎症几乎总是先于纤维化。持续性肝纤维化可进展为肝硬化，最终导致器官衰竭和死亡。黄连解毒汤通过降低细胞外基质的主要成分Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量而发挥抗纤维化作用。肝星状细胞是肝脏特异性间充质细胞，在肝纤维化形成中起关键作用。肝星状细胞的激活是肝纤维化发展过程中的关键事件[19]。在本研究中，我们观察到α-SMA在糖尿病肝组织中的高表达，它是肝星状细胞活化的生物标志物。黄连解毒汤可通过降低α-SMA的表达来调节肝星状细胞的活化。TGF-β是肝纤维化发生发展中最重要的因素。因此，本研究主要围绕TGF-β/Smad信号通路来解释黄连解毒汤抑制肝纤维化的机制。TGF-β与其受体结合后，Smad2/3发生磷酸化并被激活，然后与Smad4结合移位到细胞核内，启动染色质复合体的形成，调节基因表达[20]。

综上所述，本研究发现，黄连解毒汤可通过减轻氧化应激和抑制炎症，减轻2型糖尿病大鼠的肝脏脂质沉积和肝纤维化。这种对糖尿病肝损伤的保护作用与抑制NF-κB介导的炎症通路和抑制TGF-β/Smad信号通路有关。