不同前处理方法对粮油中黄曲霉毒素B1检测效果对比

黄 力, 杨 静, 李滑滑, 洪 玲, 沈 娜, 曾奎杰

(湖南省粮油产品质量监测中心；稻谷及副产物深加工国家工程实验室，长沙 410201)

黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物， 其中AFB1毒性和危害最大，且热稳定好，268 ℃以上的高温下才裂解。世界卫生组织(WHO)癌症研究机构将黄曲霉毒素确定为1A类致癌物，具有致癌、致畸和引起肝脏损伤的作用[1，2]。粮食和油料作物中黄曲霉毒素的污染问题受到了广泛关注，世界各个国家和地区均对其制定了限量标准[3，4]。因此，对粮食和油料作物中黄曲霉毒素进行准确检测就显得十分关键。

高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法适用于实验室内精确定量，但基于黄曲霉毒素样品基质复杂、含量低等问题，常需要进行样品前处理使其富集纯化。目前，免疫亲和柱净化处理其具有基质干扰少、特异性强、灵敏度高等优点已得到广泛的应用[5-8]，并且大部分实验室对样品中黄曲霉毒素检测前处理时常采用手动净化处理。随着科技的进步，为了简化前处理过程，提高检测的自动化水平和检测效率，一些学者已研制全自动亲和纯化仪、免疫磁珠-全自动净化仪等前处理仪器应用于食品中真菌毒素的检测[9-11]。针对国内外文献还没有系统地对比研究这3种前处理方法测定粮油中黄曲霉毒素的净化效果，本研究通过优化色谱条件后，建立柱后光化学衍生-高效液相色谱法，从加标回收率、实样检测、检测时长、操作步骤及净化效果等多个角度考察了常规手动亲和柱净化、全自动亲和柱净化及免疫磁珠-全自动净化3种前处理方法对粮油中黄曲霉毒素B1的残留净化效果的影响，以探讨这3种前处理方法对粮油中黄曲霉毒素B1检测的适用性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪，230 Volt, 50 Hz,8 Watt光衍生器，JJHZ-10免疫磁珠-全自动净化仪，KY-APS-Ⅱ全自动亲和纯化仪。

黄曲霉毒素标准物质(AFB1含量为1.083 μg/mL)、黄曲霉毒素B1免疫亲和柱、黄曲霉毒素B1免疫磁珠试剂盒、乙腈、甲醇为色谱纯、超纯水由明澈-D24uv超纯水机制备、稻谷、玉米、花生油质控样品(MRM0011)、氯化钠为分析纯、微纤维滤纸。

1.2 试样制备及提取

采样量需大于1 kg，稻谷去除杂质，经砻谷机去壳制得糙米，粉碎，过筛，使其粒径小于2 mm孔径实验筛，混合均匀后缩分至100 g，储于样品瓶中备用。

称取5 g试样(精确到0.01 g)，加入1.0 g氯化钠，于50 mL离心管中，加入25 mL 70%甲醇水溶液提取液，涡旋混匀，置摇床(200～300 r/min)剧烈振荡20 min，在4 000 r/min离心5 min，取上清液备用。

1.3 常规手动亲和柱净化

取1.2上清液10 mL，加入20 mL蒸馏水稀释于50 mL离心管中，涡旋混匀，再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液，作为上样液。

净化过程：免疫亲和柱平衡后，柱上面连接25 mL一次性注射器，准确移取15 mL上样液，调节开关，使液体以1～2 d/s的速度流出；待液体排干后，用去离子水洗涤2次，每次10 mL ；待液体排干后，上样1 mL甲醇，流速1 d/s，收集洗脱液，用水稀释定量至2 mL，最后用0.22 μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶，用于液相分析。

1.4 全自动亲和柱净化

取1.2上清液10 mL，加入20 mL蒸馏水稀释于50 mL离心管中，涡旋混匀，再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液。

将亲和柱与上样管按照要求组合后，准确移入上样液15 mL，启动全自动亲和净化仪，等程序结束后，向收集管中加入1.0 mL纯水，混合后用0.22 μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于液相分析。

1.5 免疫磁珠-全自动净化

取1.2上清液1.0 mL，加入试剂盒的样品孔(1孔位)中，将试剂盒放入免疫磁珠-自动净化仪，启动仪器，待自检完成后，通过二维码扫入净化程序，运行程序。

程序结束后，向样品孔(5孔位)加入0.5 mL纯水，混合后用0.22 μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶，用于液相分析。

免疫磁珠试剂盒重复处理方法：将首次使用过的免疫磁珠试剂盒样品孔(5孔位)吹干，准确移取0.5 mL甲醇，重新置于免疫磁珠-自动净化仪进行使用。

1.6 优化后液相色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse plus C18(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流动相：64%水+18%甲醇+18%乙腈；流速：1.2 mL/min；柱温：30 ℃；进样体积：100 μL；激发波长：360 nm；发射波长：440 nm。

1.7 标准溶液配制

取质量浓度为1.083 μg/mL 黄曲霉毒素B1标准溶液，加入50%甲醇溶液，将其依次稀释成质量浓度为0.677、1.354、2.708、5.415、10.830、21.660ng/mL的黄曲霉毒素B1标准工作液。

2 结果与讨论

2.1 优化色谱条件

由于黄曲霉毒素在粮油中主要是以AFB1、AFB2、AFG1及AFG24种形式存在，并且黄曲霉毒素AFB1、AFG1在水溶液中易发生荧光淬灭，在进行高效液相色谱法测定前要衍生化处理。所以本研究采用柱后光化学衍生高效液相色谱法，可使AFB1、AFG1荧光强度大大提高，其方法还具有不需要特殊的化学试剂、衍生过程简单、操作方便等优点。

粮油提取物中化学成分复杂，因此本实验对色谱柱、流动相配比进行了详细的考察。本实验考察了ZORBAX Eclipse plus C18(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)和ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm, 5.0 μm)对目标化合物分离效果的影响。结果表明，采用ZORBAX Eclipse plus C18和ZORBAX SB-C18[8]均能较好地分离粮油中AFB1、AFB2、AFG1及AFG24种形式的黄曲霉毒素，尤其是ZORBAX Eclipse plus C18能使AFB1目标化合物峰形更加的对称，且能保证在流动相配比不同情况下，AFB1峰面积都能基本一致(见图1)。因此本研究选择ZORBAX Eclipse plus C18(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)分离AFB1。

本实验考察了不同流动相配比(60%水+20%甲醇+20%乙腈、64%水+18%甲醇+18%乙腈、68%水+16%甲醇+16%乙腈)对目标化合物分离效果的影响(见图1)，结果发现，增加水相配比，可使4种形式的黄曲霉毒素分离的更开，但耗时更长。因此，结合目标化合物的分离度和保留时间，最终选择流动相配比64%水+18%甲醇+18%乙腈。

注：a为60%水+20%甲醇+20%乙腈；b为64%水+18%甲醇+18%乙腈；c为68%水+16%甲醇+16%乙腈。图1 采用不同流动相配比时黄曲霉毒素的色谱图

2.2 线性关系、检出限和定量限

以1.083 μg/mL 黄曲霉毒素B1标准溶液稀释所得的黄曲霉毒素B1标准工作液( 0.677～21.660 ng/mL)，在确定的色谱条件下进行测定。以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制标准曲线。实验结果表明，黄曲霉毒素B1含量在0.677～21.660 ng/mL的范围内线性关系良好，线性方程：If=1.757c+0.037，其相关系数R2为0.999 97。在空白稻谷样品中添加目标化合物，以3倍信噪比(S/N)确定方法的检出限(LOD)为0.029 μg/kg；以10倍的倍信噪比确定方法的定量限(LOQ)为0.097 μg/kg，完全能满足粮食中黄曲霉毒素B1的测定需求。

2.3 准确性和重复性

选取不含黄曲霉毒素B1的稻谷样品进行加标和重复性实验，样品中添加了不同质量浓度的标准溶液(添加量相当于黄曲霉毒素B1含量5.0、10.0、20.0 μg/kg)后，放置60 min，使待测成分与样品基体成分相互作用达到平衡，再应用3种前处理方法进行操作，其回收率和相对标准偏差结果见表1。3个浓度水平加标回收率为82.1%～99.2%，3次重复测定的相对标准偏差为0.2%～8.8%，符合一般痕量分析要求。与其他2种前处理测定结果相比较，全自动亲和柱净化的回收率偏低，3次重复测定的相对标准偏差偏大。

表1 稻谷中黄曲霉毒素B1的加标回收率及相对标准偏差(n=3)

2.4 实际样品分析

选取1份花生油质控样品(MRM0011)、1份阳性稻谷样品和1份阳性玉米样品分别利用已建立光化学衍生-高效液相色谱分析方法对其所含黄曲霉毒素B1进行测定(见表2)。其中阳性稻谷样品中黄曲霉毒素B1的色谱图见图2(常规手动亲和柱净化和全自动亲和柱净化最终稀释倍数为2；免疫磁珠-全自动净化最终稀释倍数为5)。结果发现，3种前处理方法对粮油中黄曲霉毒素B1的测定均能达到较好的效果，常规手动亲和柱净化和免疫磁珠-全自动净化的效果更加的明显，其中免疫磁珠-全自动净化可实现重复利用，且结果影响较小。

表2 3种前处理方法测得实际样品中黄曲霉毒素B1的含量(n=3)

图2 3种前处理方法对阳性稻谷样品中黄曲霉毒素B1的色谱图

2.5 3种前处理操作过程比较

本实验从检测时长、操作步骤及净化效果考察了常规手动亲和柱净化、全自动亲和柱净化及免疫磁珠-全自动净化3种前处理净化方法。从检测时长来看，因常规手动亲和柱净化需要单个手动操作，每一个样品净化时长约30 min；全自动亲和柱净化采用全自动亲和纯化仪，引入自动进样器，可实现30 min内净化约15个样品；免疫磁珠-全自动净化采用免疫磁珠试剂盒，同时处理10个样品能在30 min内净化完成。从操作步骤来看，常规手动亲和柱净化和全自动亲和柱净化两者的操作步骤依次都是经过样品提取、稀释、上样、洗涤和洗脱，免疫磁珠-全自动净化是将样品中真菌毒素提取后，直接准确加入提取的上清液，二维码扫描导入或调用程序，一键式操作。常规手动亲和柱净化和全自动亲和柱净化两种前处理方法为了防止堵塞亲和柱，都需对提取的样液进行稀释、微纤维滤纸预过滤处理，从而使其操作步骤繁琐。从净化效果来看，常规手动亲和柱净化在空白稻谷基质条件下加标3梯度回收率范围在95.4%～99.2%，全自动亲和柱净化为82.1%～89.9%，免疫磁珠-全自动净化首次使用为92.6%～96.5%，免疫磁珠-全自动净化重复使用为90.8%～93.3%，这与实际样品分析结果一致。可见，全自动亲和柱净化效果低于另外2种前处理方法，其原因可能是与全自动亲和纯化仪在上样流速、气推次数等因素设定不当影响到净化效果[9]。但总的来说，3种前处理方法对粮油中黄曲霉毒素B1的测定均能达到较好的效果，常规手动亲和柱净化和免疫磁珠-全自动净化的效果更加的明显，其中免疫磁珠-全自动净化还实现了重复利用，且耗时最短。

3 结论

本研究建立了以甲醇+水(70∶30)为提取液，以常规手动亲和柱净化、全自动亲和柱净化及免疫磁珠-全自动净化3种前处理净化手段，光化学衍生-高效液相色谱为检测仪器的黄曲霉毒素B1的检测方法。从实验结果来看，3种前处理净化手段均适合粮油中黄曲霉毒素B1的样品前处理，但免疫磁珠-全自动净化更能突显其优势，该方法快速简便、定量准确、可实现重复利用，可以广泛用于粮油中黄曲霉毒素B1的检测。