补肾生精调和气血法对卵巢储备功能低下大鼠氧化应激的影响

黄佳梅，蔡紫璨，张 花,，唐 娜，万 维，金志春,

(1. 湖北中医药大学，湖北 武汉 430065；2. 华中科技大学附属湖北妇幼保健院，湖北 武汉 430070)

氧化应激是指机体氧化还原系统失衡，自由基显著增加到超过内源性抗氧化系统的清除能力。正常人体内活性氧物种和抗氧化物酶水平维持着平衡，当平衡被打破时，则活性氧产生过多，引发机体氧化应激反应，可导致卵母细胞老化[1]。卵母细胞的老化主要表现为卵母细胞数量和质量的逐渐下降，可直接导致女性卵巢储备功能低下(DOR)，从而出现生殖内分泌功能紊乱、生育能力降低[2]。DOR主要病理改变是卵巢中储备的卵泡较同龄女性显著减少，可进一步发展为卵巢早衰。目前DOR以激素替代治疗为主以维持性激素功能，但长期激素治疗的风险和不良反应较多[3-4]，对有生育要求的女性不能改善生殖功能。 课题组前期临床研究显示，补肾生精调和气血法可调节体外授精-胚胎移植术患者降调日、HCG日及取卵日血清雌二醇(E2)、孕酮(P)水平，增加卵泡对外源性促性腺激素的敏感性[5]；动物研究发现，补肾生精调和气血法可上调血管内皮生长因子(VEGF)/血管内皮生长因子受体(VEGFR)及其受体flt-1、kdr蛋白的表达，促进卵巢组织间质血管生成，间接改善卵巢储备功能[6-7]。本实验通过观察DOR大鼠血清及卵巢组织中氧化应激反应标志物的变化，进一步探究了补肾生精调和气血法改善卵巢储备功能的作用机制。

1 实验材料与方法

1.1动物 SPF级成熟雌性SD大鼠60只，体重200～220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，华中科技大学实验动物中心使用许可证编号：SYXK(鄂)2016-0057。大鼠适应性喂养7 d，室温24～25 ℃，湿度50%～60%，光照周期12/12 h，自由摄食饮水。本动物实验经华中科技大学动物伦理委员会审批通过(S2699)。

1.2药物 注射用环磷酰胺(安道生，德国Baxter Oncology GmbH公司，规格：0.2 g×1支，批号：1A445A)；戊酸雌二醇片(补佳乐，拜尔医药保健有限公司，每片含戊酸雌二醇1 mg，批号：626A)。补肾生精调和气血法中药复方：按组方比例称取菟丝子105 g、补骨脂70 g、枸杞子105 g、熟地黄105 g、山茱萸105g、山药105g、当归70g、川芎70g、白芍70 g、香附70 g、党参105 g、黄芪105 g、白术105 g，饮片由湖北省妇幼保健院中药房提供。取总药材2倍量双蒸水浸泡药材20 min后，武火煎煮，沸后文火再煎20 min；再加2倍量双蒸水，武火沸后文火再煎20 min；将2次中药汤剂均匀混合，并用旋转蒸发仪浓缩至生药浓度1 g/mL，4 ℃密封保存备用。参照“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表”换算给药剂量。

1.3试剂 卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,货号分别为E-EL-R0391c、E-EL-R0026c);E2、抗苗勒管激素(AMH)检测试剂盒(罗氏诊断产品上海有限公司，货号分别为06656021190，06331076190);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、总抗氧化能力(T-AOC) 测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号分别为A003-1，A001-3，A006-2-1，A015-3-1)；兔血红素氧合酶1(HO-1)抗体、鼠醌氧化还原酶1(NQO-1)抗体(武汉三鹰生物技术有限公司,货号分别为10701-1-AP，67240-1-lg)；DAKO免疫组化试剂盒(货号为KG500705)；大鼠HO-1内参引物、NQO-1内参引物(武汉恒意赛生物科技有限公司，货号分别为017000，012580)，NucleoZOL试剂(德国MACHEREY-NAGEL公司，货号为 740406.50)，Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit试剂盒(美国New England Biolabs公司,#E3005S)。

1.4主要仪器 酷贝i200电子秤；DM4000生物显微镜(德国Leika)；iMark酶标仪(美国Bio-Rad公司)、Access全自动电化学发光免疫分析仪(美国Beckman couiter公司)；Mini-PROTEAN Tetra电泳槽、MP4小型垂直电泳转印系统(美国Bio-Rad公司)、4 ℃旋转摇床QBQ-206(其林贝尔公司)、化学发光成像分析系统BG-gdsAUTO 710 MINI(上海Baygene生物技术有限公司)、高速冷冻离心机(美国Thermofisher公司)、超微量分光光度计P100+(美国Pultton公司)、CFX Connect荧光定量PCR检测系统(美国Bio-Rad公司)；-80 ℃超低温冰箱(美国Thermofisher公司)。

1.5实验方法 适应性喂养结束次日起，每日检查实验大鼠阴道脱落细胞，观察动情周期变化情况。将大鼠按随机数字表分为空白组、环磷酰胺组、戊酸雌二醇组及补肾生精调和气血方低、中、高剂量组，每组10只。参照前期预实验研究，空白组大鼠给予生理盐水腹腔注射，其余各组大鼠给予75 mg/kg环磷酰胺单次腹腔注射建立DOR模型。次日，戊酸雌二醇组给予戊酸雌二醇0.105 mg/kg灌胃，补肾生精调和气血方低、中、高剂量组分别给予补肾生精调和气血方8.075 g/kg、16.15 g/kg、32.3 g/kg灌胃，空白组和环磷酰胺组给予等量去离子水灌胃，均每日1次，连续21 d。

1.6观察指标及方法

1.6.1大鼠一般情况及动情周期 自实验开始后每日观察各组大鼠一般情况，包括饮食摄水量、皮毛色泽、精神状态、二便情况、体重，同时进行阴道脱落细胞涂片，观察动情周期变化。

1.6.2血清FSH、LH、E2、AMH、MDA、SOD、GSH、T-AOC水平 灌胃结束后次日，麻醉各组大鼠并心尖取血，分离血清。采用ELISA法检测FSH、LH水平，采用电化学发光法检测E2、AMH水平，采用TBA法检测MDA水平，采用WST-1法检测SOD水平，采用微板法检测GSH水平，采用FRPA法检测T-AOC水平。

1.6.3卵巢病理形态 取血后取出一侧卵巢置于4%多聚甲醛中固定，48 h后进行组织浸蜡脱水、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察卵巢组织学变化。

1.6.4卵巢组织中HO-1、NQO-1蛋白表达情况①Western blot法检测：取出干冰速冻的部分卵巢组织，RIPA裂解并提取卵巢组织总蛋白，按照蛋白定量试剂盒进行样本蛋白含量测定，加5X Laemmli混匀-80 ℃冰箱保存备用。以鼠β-actin为内参，进行凝胶电泳、转膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗、发光，使用Image J软件测定图像平均灰度值。②免疫组化法检测：取4%多聚甲醛固定的部分卵巢组织进行浸蜡脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、修复，冷却至室温，按照两步法试剂盒说明书进行操作，一抗HO-1(1∶200)、NQO-1(1∶2 500)室温40 min。DAB显色，中止后苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察染色结果并拍照。

1.6.5卵巢组织中HO-1、NQO-1mRNA表达情况 采用实时荧光定量PCR法检测：取出干冰速冻的部分卵巢组织，NucleoZOL裂解并提取卵巢组织中总RNA，测定RNA样品浓度，设计目的基因对应引物，HO-1、NQO-1引物序列见表1。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，按照Luna Universal One-Step RT-qPCR Kitsihe试剂盒说明书操作。结果使用Bio-Rad CFX Manger软件进行数据处理及分析并计算样本mRNA的相对表达量。

表1 目的基因引物序列

1.7统计学方法 实验数据采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。多组间计量资料比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠体重变化情况 适应性喂养期间各组大鼠体重同步增加；造模后7 d内，环磷酰胺组、补肾生精调和气血方高剂量组大鼠体重增加较其余组缓慢；造模后14 d内，各组大鼠体重均逐渐增加；造模后21 d内，各组大鼠体重增加速度趋于同步。见图1。

1～7 d为适应性喂养期间；7～28 d为造模后灌胃期间图1 空白组和卵巢储备功能低下各组大鼠适应性喂养期间和造模后灌胃期间体重变化

2.2各组大鼠动情周期变化情况 适应性喂养期间，大鼠阴道涂片可见动情前期、动情期、动情后期、动情间期规律的周期性改变。造模后，除空白组大鼠动情周期基本稳定外，其余各组大鼠动情周期逐渐出现紊乱，表现为周期停滞、延长或无明显周期性变化。灌胃结束，环磷酰胺组大鼠均存在动情周期紊乱，戊酸雌二醇组3只(30%)、补肾生精调和气血方低剂量组4只(40%)、补肾生精调和气血方中剂量组2只(20%)、补肾生精调和气血方高剂量组2只(20%)存在动情周期紊乱。

2.3各组大鼠血清性激素水平 与空白组比较，环磷酰胺组血清FSH、LH水平均明显升高(P均<0.05)，血清AMH水平明显降低(P<0.05)，血清E2水平变化不明显(P>0.05)；与环磷酰胺组比较，戊酸雌二醇组及补肾生精调和气血方中剂量组血清FSH水平和各药物组血清LH水平均明显降低(P均<0.05)，戊酸雌二醇组及补肾生精调和气血方中剂量组血清E2水平均明显升高(P均<0.05)，各药物组血清AMH水平变化不明显(P均>0.05)。见图2。

图2 空白组和卵巢储备功能低下各组大鼠血清FSH、LH、AMH、E2水平

2.4各组大鼠血清氧化应激指标水平 与空白组比较，环磷酰胺组血清MDA水平明显升高(P<0.05)，血清SOD、T-AOC水平均明显降低(P均<0.05)，血清GSH水平变化不明显(P>0.05)；与环磷酰胺组比较，戊酸雌二醇组及补肾生精调和气血方各组血清MDA水平均明显降低(P均<0.05)，血清SOD、T-AOC水平均明显升高(P均<0.05)，且戊酸雌二醇组及补肾生精调和气血方中剂量组血清GSH水平均明显升高(P均<0.05)。见图3。

图3 空白组和卵巢储备功能低下各组大鼠血清氧化应激指标水平

2.5各组大鼠卵巢组织病理形态 空白组大鼠卵巢组织中见各级卵泡均匀生长(包括初级卵泡、次级卵泡、发育卵泡)；环磷酰胺组大鼠卵巢皮质处生长卵泡较少，以初级卵泡为主，且部分卵泡内仅1～2层颗粒细胞环绕，闭锁卵泡增多(卵泡内环绕的颗粒细胞层次不清晰或减少，透明带皱缩、卵泡壁塌陷)；各药物组卵巢皮质生长卵泡数量较环磷酰胺组明显增多，闭锁卵泡减少，且黄体组织体积增大。见图4。

深色箭头指示为生长卵泡；浅色箭头指示为闭锁卵泡图4 空白组和卵巢储备功能低下各组大鼠卵巢组织形态(HE染色，×100)

2.6各组大鼠卵巢组织中HO-1、NQO-1蛋白表达情况 环磷酰胺组HO-1、NQO-1蛋白相对表达量均明显低于空白组(P均<0.05)，戊酸雌二醇组HO-1蛋白相对表达量明显低于环磷酰胺组(P均<0.05)，补肾生精调和气血方高剂量组HO-1蛋白相对表达量和补肾生精调和气血方低剂量组NQO-1蛋白相对表达量均明显高于环磷酰胺组和戊酸雌二醇组(P均<0.05)，见图5。免疫组化检测显示HO-1、NQO-1主要表达在卵母细胞、卵泡液、颗粒细胞中，其中在卵母细胞、卵泡液中呈强表达，间质细胞中呈弱表达，且与NQO-1蛋白相比，HO-1蛋白在卵巢组织中表达更强，各组间HO-1、NQO-1蛋白表达趋势与Western blot法检测基本一致，见图6及图7。

图5 空白组和卵巢储备功能低下各组大鼠卵巢组织中HO-1、NQO-1蛋白表达情况

图6 空白组和卵巢储备功能低下各组大鼠卵巢组织中HO-1蛋白表达情况(免疫组化，×200)

图7 空白组和卵巢储备功能低下各组大鼠卵巢组织中NQO-1蛋白表达情况(免疫组化，×200)

2.7各组大鼠卵巢组织中HO-1、NQO-1mRNA表达情况 环磷酰胺组HO-1、NQO-1mRNA相对表达量均较空白组低，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；补肾生精调和气血方中、高剂量组HO-1mRNA相对表达量均明显高于环磷酰胺组(P均<0.05)；各药物组NQO-1mRNA相对表达量均较环磷酰胺组高，但组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图8。

图8 空白组和卵巢储备功能低下各组大鼠卵巢组织中HO-1、NQO-1mRNA表达情况

3 讨 论

DOR发病机制尚不完全明确，目前普遍认为其与颗粒细胞过度凋亡，导致卵泡闭锁有关[8]。卵母细胞与颗粒细胞关系密切，卵母细胞产生的生长分化因子(GDF-9)可通过抑制颗粒细胞凋亡，防止卵泡闭锁，促进卵泡的生存和增殖；当GDF-9表达下调时，可以激活Caspase-3，引起颗粒细胞凋亡, 最终触发卵泡闭锁[9]。氧化应激可以诱导卵母细胞、颗粒细胞凋亡，在卵泡促凋亡信号出现之前就可以检测到活性氧水平显著上升[2，10]。环磷酰胺是一种烷基化化疗药物，对成年雌性大鼠单次大剂量注射环磷酰胺24 h后，可造成卵巢颗粒细胞凋亡和次级卵泡、有腔卵泡的破坏[11]。有研究发现，使用4-氢过氧化环磷酰胺(4HC)快速处理过的COV434细胞，细胞内GSH耗竭，活性氧水平迅速升高，凋亡细胞数量显著增加，提示活性氧可介导环磷酰胺诱导的颗粒细胞凋亡[12]。MDA、SOD、GSH、T-AOC、HO-1、NQO-1因子是参与机体氧化应激的主要内源性活性因子，MDA是活性氧介导的脂质过氧化降解产物，SOD是体内重要的抗氧化酶，HO-1和NQO-1是机体抵抗氧化应激的关键信号通路Nrf2/Keap1下游靶基因。本实验结果显示，环磷酰胺组大鼠动情周期紊乱，血清FSH、LH、MDA水平升高，血清AMH、E2、SOD、T-AOC水平降低，卵巢组织中生长卵泡数量减少、闭锁卵泡数量增多，卵巢组织中HO-1、NQO-1蛋白表达下调，表明DOR大鼠存在卵巢氧化应激损伤。

卵巢的抗氧化系统直接影响卵泡活性氧和抗氧化酶的种类与水平，从而对颗粒细胞的凋亡以及卵泡闭锁产生不同的影响。近年来中西医干预DOR 氧化损伤机制的研究逐渐增多，其中中药复方和单体、艾灸、针刺等可通过多环节、多途径作用减轻自由基对卵巢的损伤，提高卵巢抗氧化能力，改善卵母细胞质量[13]。Yang等[14]研究发现，灸“足三里”可提高围绝经期大鼠血清SOD活性，降低血清MDA水平，上调卵巢组织中HO-1和NQO1 mRNA及蛋白表达水平。方晨晨等[15]研究指出，针刺肾俞、关元、中脘穴可降低DOR大鼠血清MDA水平，升高血清SOD水平，上调卵巢组织中Bcl-2蛋白表达，提高大鼠抗卵巢氧化应激的能力，抑制卵泡颗粒细胞凋亡。

中医关于DOR的有关论述可见于“经水早断”“经水过少”“闭经”“不孕”等疾病中。中医认为，肾藏精，主生殖，肾精滋养五脏，五脏气血充养肾精肾气，肾与五脏、精血互生。若妇人年未老而肾精和冲任气血提前衰少，五脏气血生化乏源，便会出现DOR相关临床症状。补肾生精调和气血法中熟地、山药、山茱萸补肾生精，加菟丝子、补骨脂平补肾阴肾阳，枸杞子平补肝肾；当归、川芎、白芍、熟地养血活血，精血互生，补血以生精；党参、白术、黄芪健脾益气，脾气健则血生；香附行气解郁，善行血中之气，使补而不滞。全方补肾生精，健脾益气，养血活血，行气解郁，调补冲任。本实验结果显示，各药物组大鼠动情周期逐渐恢复；补肾生精调和气血方中剂量组大鼠血清FSH、LH、MDA水平均明显降低，血清E2、SOD、GSH、T-AOC水平均明显升高；卵巢内生长卵泡数量增多，闭锁卵泡数量减少；补肾生精调和气血方高剂量组HO-1蛋白相对表达量、补肾生精调和气血方低剂量组NQO-1蛋白相对表达量及补肾生精调和气血方中、高剂量组HO-1 mRNA相对表达量均明显增高。表明补肾生精调和气血法可调节DOR大鼠性激素分泌，改善大鼠卵巢储备功能，提高卵巢抗氧化能力。

综上所述，补肾生精调和气血法可能通过提高卵巢抗氧化能力，抑制颗粒细胞凋亡，减少卵泡闭锁，从而改善卵巢储备功能。本研究为临床补肾生精调和气血法治疗DOR患者，延缓卵巢功能减退提供了一定理论依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。