通窍益智颗粒对血管性痴呆大鼠血脑屏障功能及血管新生的影响及机制研究

任俊豪,徐 萍,李双阳,唐红梅,王饶琼,白 雪

(1. 西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000；2. 四川省自贡市第三人民医院，四川 自贡 643000)

血管性痴呆是由各种脑血管病危险因素及脑血管病引起不同程度的学习和记忆能力障碍为主要表现的临床综合征[1]，是继阿尔茨海默病之后的第二大痴呆类型，早期预防及治疗对延缓病情进展具有重大意义。脑生理功能的维持依赖于良好的血氧供应，脑血管事件引起脑血流量下降，缺氧缺血导致神经血管解耦联，同时可继发多种病理生理损伤[2]，其中以血脑屏障损伤为核心的神经血管单元功能障碍是血管性痴呆的早期核心病理环节[3-4]。有研究证实，脑缺氧缺血状态可导致血脑屏障损伤，且血脑屏障的改变甚至早于认知障碍临床症状的出现，提示血脑屏障损伤可能是血管性痴呆的早期标志和干预靶点，改善血脑屏障功能，促进血管新生，改善脑血流灌注，从而恢复神经血管单元的功能是血管性痴呆防治的重点[5-6]。课题组基于全国名老中医王明杰“玄府理论”[7]，认为血管性痴呆的根本病机为脑玄府郁闭，神机失用，提出重用风药开通玄府，辅以虫类药，佐以补益药的配伍原则。前期研究表明风药组方开通玄府可改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力[8-9]。结合脑玄府与神经血管单元在形态、功能和病理方面的高度相似性，本实验进一步观察了风药组方通窍益智颗粒对血管性痴呆大鼠血脑屏障超微结构和通透性、海马CA1区微血管密度及血管新生相关蛋白表达的影响，从脑玄府与神经血管单元的角度探讨了该组方治疗血管性痴呆的可能机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 健康雄性SD大鼠130只，8～10周龄，体重220～250 g，购自西南医科大学实验动物中心，生产和使用许可证:SCXK(川)2018-17,SYXK(川)2018-065。所有大鼠均按照3～5只/笼的标准分笼饲养，饲养环境温度(22±2)℃，自由饮食、饮水，适应性喂养7 d后开始造模。实验经西南医科大学实验动物伦理委员会审核通过(DWLL2018001)。

1.2主要实验药物 通窍益智颗粒组方：葛根30 g(四川)、黄芪30g(甘肃)、人参10g(吉林)、水蛭3 g(河北)、地龙10 g(广东)、灵芝15 g(四川)、川芎15 g(四川)、石菖蒲15 g(四川)，药物购自西南医科大学附属中医医院并由制剂室制备。水蛭、地龙经70%乙醇浸泡1周后提取蛋白备用，提取石菖蒲挥发油备用，其余药物经3次水煎后混匀，过滤残渣，并加入提取后蛋白及挥发油制为3 g/mL的浓缩液。尼莫地平片：山西亚宝药业集团股份有限公司，国药准字H14022821，规格：20mg/片，蒸馏水配置成2 mg/mL的混悬液备用。

1.3试剂及仪器 Anti-血管生成素-1(Ang-1)(Abcamab102015)；Anti-血管生成素-2(Ang-2)(proteintech 24613-1-AP)；Anti-内皮细胞TEK酪氨酸激酶(Tie2) (proteintech 19157-1-AP)；Anti-主要促进因子超家族成员2a(Mfsd2a)多克隆抗体(Abcam ab105399)；Anti-紧密连接相关蛋白(Occludin)(Thermo Fisher OC-3F10)；Morris水迷宫(成都泰盟)；光学显微镜(日本奥林巴斯株式会社)；机械组织匀浆机(瑞士KINEMETICA)；透射电镜JEM-1011 (日本电子公司)。

1.4实验方法 随机选取20只大鼠作为假手术组，分离但不结扎双侧颈总动脉；其余大鼠采取双侧颈总动脉永久性结扎法制备血管性痴呆模型[10]，术后肌注青霉素钠80 000 IU/d，连续3 d。术后28 d根据Morris水迷宫测试的大鼠逃避潜伏期[11]筛选出造模合格的大鼠，将100只造模成功大鼠随机分为模型组、尼莫地平组及通窍益智颗粒高、中、低剂量组，每组20只。根据人和动物等效剂量换算关系，通窍益智颗粒高、中、低剂量组每天给予通窍益智颗粒23.54 g/kg、11.77 g/kg、5.88 g/kg灌胃，尼莫地平组每天给予尼莫地平6.25 mg/kg灌胃，假手术组和模型组每天给予2 mL生理盐水灌胃，各组均连续灌胃28 d。

1.5观察指标及方法

1.5.1学习、记忆能力 采用Morris水迷宫评价。定位航行实验：平台随机放置于第Ⅲ象限的中心，灌胃结束后将大鼠面向第Ⅰ象限水池壁中央放入水中，记录90 s内大鼠从入水到爬上隐藏平台停留至少2 s这个过程所用时间即逃避潜伏期，同法依次记录第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限逃避潜伏期。实验90 s仍未找到平台大鼠，人为引导其找到平台并在上面停留20 s，记录实验结果为90 s。每天中午训练1次，连续5 d,根据大鼠逃避潜伏期评估大鼠学习能力。完成定位航行实验后，第6天移去平台，使大鼠由任一象限入水，记录90 s内大鼠在目标象限停留时间及穿过原平台次数，连续训练2 d，每天1次，以评价大鼠的记忆能力。

1.5.2血脑屏障通透性 每组随机选取4只大鼠，尾静脉注射0.5%伊文思蓝溶液(5 mL/kg)，见大鼠巩膜皮肤变蓝1 h后，予以3.6%水合氯醛溶液5 mL/kg腹腔麻醉，开胸暴露心脏，生理盐水灌注，以右心耳流出液由血色转为清澈，肺、肝脏变白为准，开颅取脑，称重后装入EP管。剪碎标本，加入1.5 mL PBS液，制成匀浆， 4 ℃下2 000 r/min离心30 min，取上清液1 mL，加入等量100%三氯乙酸，4 ℃孵育24 h后，4 ℃下2 000 r/min离心30 min，取上清液200μL加入孔板，1∶1的比例配置空白对照液(即1 mL 100%三氯乙酸∶1 mL PBS液)，伊文思蓝标准液配置：0.5%伊文思蓝0.1 mL加入0.4 mL空白对照液中配置成第一管液(1 000 000 ng/mL)，取上述液体0.1 mL加入0.1 mL空白对照液配置成第二管液(500 000 ng/mL)，以此类推操作，至第十三管液(244.140 625 ng/mL)，酶标仪检测吸光值(OD值)。以第六管至第十三管液的OD值绘制标准曲线，计算每克脑组织中伊文思蓝含量。

1.5.3血脑屏障超微结构 每组随机选取4只大鼠，麻醉取脑剥离海马，4%戊二醛电镜固定液低温(4 ℃)暂存20 min，双面刀片样本修整并组织修剪，3.5%戊二醛电镜固定液前固定，1%饿酸固定液后固定，丙酮逐级脱水，环氧树脂Epon618渗透、包埋，聚合，半薄切片，光镜定位，超薄切片机切片，捞至铜网后予柠檬酸铅-醋酸铀双染色(室温下15～20 min)，透射电镜观察血脑屏障超微结构。

1.5.4微血管密度 每组随机选取4只大鼠，麻醉后以生理盐水灌注，再以4%多聚甲醛溶液灌注,取全脑组织，用4%多聚甲醛固定24 h，剪出海马所在部位，按蔗糖浓度梯度脱水，常规冰冻包埋切片，每片厚约6 μm，每个组织随机取3张玻片，PBS溶液洗除OCT包埋剂，组化笔划圈，滴加0.5%Triton X-100室温通透20 min，山羊血清封闭1 h，滴加一抗CD31(1∶500)，4 ℃孵育过夜，PBS浸洗3次，滴加荧光标记二抗(1∶200)，37 ℃避光孵育1 h，PBS浸洗3次，滴加DAPI(1∶1 000)，室温染色5 min，PBS浸洗3次，甘油明胶封片。于荧光显微镜下观察，100倍视野扫视，选择海马CA1区血管密度最高的区域，再200倍视野下计数5个视野内被染色的血管数，计算平均值即微血管密度。

1.5.5海马组织中Mfsd2a、occludin、Ang-1、Ang-2、Tie2蛋白表达情况 采用Western blot法检测。每组随机选取8只大鼠，麻醉后进行生理盐水灌注，开颅取脑，冰上分离海马放入EP管内-80 ℃保存。取适量海马组织冰上匀浆，提取蛋白，BCA法测蛋白浓度，配平后采用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转膜后5%BSA封闭，对应一抗(Ang-1、Ang-2、Tie2、Mfsd2a、Occludin稀释比例均为1∶500,β-actin稀释比例为1∶1 000)4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ELC发光显色，凝胶成像系统曝光摄像。利用Image J软件进行靶蛋白条带灰度值测定。

2 结 果

2.1各组大鼠学习、记忆能力比较 与假手术组比较，模型组大鼠第1～5天逃避潜伏期均明显延长(P均<0.05)；第6天和第7天大鼠穿过原平台次数明显减少(P均<0.05)，目标象限停留时间明显缩短(P均<0.05)。与模型组比较，各给药组大鼠第1～5天逃避潜伏期均明显缩短(P均<0.05)；第6天和第7天大鼠穿过原平台次数明显增加(P均<0.05)，目标象限停留时间明显延长(P均<0.05)；且通窍益智颗粒高剂量组上述指标较尼莫地平组和通窍益智颗粒低、中剂量组改善明显(P均<0.05)。见表1及表2。

表2 假手术组和血管性痴呆各组大鼠穿过原平台次数和目标象限停留时间比较

2.2各组大鼠血脑屏障通透性比较 假手术组、模型组、尼莫地平组和通窍益智颗粒高、中、低剂量组大鼠脑组织中伊文思蓝含量分别为(0.26±0.02)μg/g、(6.30±0.36)μg/g、(2.31±0.41)μg/g、(1.34±0.34)μg/g、(2.14±0.25)μg/g、(3.94±0.08)μg/g，模型组及各给药组均明显高于假手术组(P均<0.05)，各给药组均明显低于模型组(P均<0.05)，通窍益智颗粒高剂量组明显低于尼莫地平组和通窍益智颗粒中、低剂量组(P均<0.05)。

2.3各组大鼠血脑屏障超微结构 假手术组大鼠血脑屏障结构清晰、完整，微血管内皮细胞紧密连接，血脑屏障基底膜完整，星形胶质细胞足突未见异常；模型组大鼠血脑屏障结构不完整，内皮细胞紧密连接松弛，细胞结构及细胞器不清，未见附着的周细胞，血脑屏障基底膜不完整，管腔表面星形胶质细胞足突水肿明显；各给药组大鼠血脑屏障超微结构较模型组均有不同程度改善，以通窍益智颗粒高剂量组改善最明显，可见血脑屏障结构清楚且较完整，内皮细胞紧密连接未见松弛，核膜较完整，周细胞附着表面，血脑屏障基底膜较完整，周围星形胶质细胞足突轻微水肿。见图1。

图1 假手术组和血管性痴呆各组大鼠血脑屏障超微结构

2.4各组大鼠海马CA1区微血管密度 假手术组、模型组、尼莫地平组和通窍益智颗粒高、中、低剂量组大鼠海马CA1区微血管密度分别为5.20±0.33，9.55±0.30，12.55±0.96，24.55±0.91，13.20±0.28，9.45±0.34，模型组明显高于假手术组(P<0.05)，尼莫地平组及通窍益智颗粒高、中剂量组均明显高于模型组和通窍益智颗粒低剂量组(P均<0.05)，通窍益智颗粒高剂量组明显高于尼莫地平组和通窍益智颗粒中剂量组(P均<0.05)。免疫荧光染色表现见图2。

图2 假手术组和血管性痴呆各组大鼠海马CA1区微血管密度(×200)

2.5各组大鼠海马组织中Mfsd2a、Occludin、Ang-1、Ang-2、Tie2蛋白表达情况 与假手术组比较，模型组大鼠海马组织中Mfsd2a、Occludin蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)，Ang-1、Ang-2、Tie2蛋白相对表达量均明显增高(P均<0.05)；尼莫地平组和通窍益智颗粒中、高剂量组大鼠海马组织中Mfsd2a、Occludin、Ang-1、Ang-2、Tie2蛋白相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05)；通窍益智颗粒高剂量组Occludin、Ang-1、Ang-2、Tie2蛋白相对表达量均明显高于尼莫地平组和通窍益智颗粒低、中剂量组(P均<0.05)，Mfsd2a蛋白相对表达量明显高于尼莫地平组和通窍益智颗粒低剂量组(P均<0.05)。见图3及表3。

图3 假手术组和血管性痴呆各组大鼠海马组织中Mfsd2a、Occludin、Ang-1、Ang-2、Tie2蛋白表达情况

3 讨 论

神经血管单元由血脑屏障、神经元、胶质细胞和细胞外基质等共同组成，是血管和实质细胞及其周围环境的集成系统，神经血管单元内各组成成分的协同工作，使脑血流供应与代谢需求相匹配，维持脑稳态[12]。慢性或急性脑灌注不足引起脑血流失调，诱导产生的炎症反应、氧化应激等导致血脑屏障破坏，激活脑内的神经胶质和炎症环境，使脑水肿加重，炎细胞浸润，进一步加重脑灌注异常并引起神经元损伤，促进神经-血管功能解耦联，诱导神经损伤出现认知障碍及神经退行性变[4，13-14]。

表3 假手术组和血管性痴呆各组大鼠海马组织中Mfsd2a、Occludin、Ang-1、Ang-2、Tie2蛋白相对表达量比较

相关研究表明，非痴呆型血管性认知障碍即可出现血脑屏障的渗漏，且发生时间远早于临床症状的出现和恶化[15]；轻度认知功能障碍患者中也观察到血脑屏障损伤早于Aβ、Tau的典型病理改变的出现[16]，提示血脑屏障损伤可能与认知障碍的发生密切相关。其中紧密连接保证了血脑屏障低通透性屏障作用，限制外源性白细胞、炎性细胞因子等有害物质进入中枢，Occludin是在包括血脑屏障在内的内皮细胞紧密连接中发现的第一个完整的膜蛋白，可有效调节血脑屏障功能[17-18]。Mfsd2a特异性表达于脑微血管内皮细胞细胞膜，通过介导血脑屏障的脂质转运和抑制脑微血管内皮细胞胞吞调控血脑屏障通透性，是血脑屏障的关键调节因子[19-20]。本实验结果显示，模型组大鼠海马组织中Mfsd2a和Occludin蛋白表达量明显降低，且电镜和伊文思蓝结果验证慢性脑缺血大鼠存在血脑屏障破坏，表现为通透性增加；通窍益智颗粒各组血脑屏障结构有所修复，通透性降低，海马组织中Mfsd2a及Occludin蛋白表达量均明显增高，提示通窍益智颗粒具有降低血管性痴呆大鼠血脑屏障通透性，保护血脑屏障的作用。

慢性脑缺血导致神经血管单元受损，会出现血管性痴呆等一系列变化[4]，而促进血管新生是改善脑灌注、恢复神经血管单元功能的有效方法[21]，新生血管也可引导神经再生，并能为胶质细胞以及损伤神经元的修复、突触重建等创造适宜的环境。Angiopoietin /Tie2信号通路是主要的血管生成通路，对于血管生成和重建、正常的血管成熟和稳定等过程至关重要[22-23]。正常情况下，神经血管单元中周细胞释放Ang-1，激活内皮细胞上的Tie2受体并促使其磷酸化，促进血管新生及完整；缺氧会促进Ang-2生成，与Ang-1竞争性结合Tie2受体，其与血管内皮祖细胞的相互作用，可能启动血管新生[24]。病理性血管生成反应是对脑血流量不足的代偿，但这种有限的代偿不足以改善神经血管单元缺血损害以及永久性缺血后神经元的损失和认知功能的损伤[25]。本实验结果显示，模型组大鼠海马微血管密度及海马组织中 Ang-1、Ang-2、Tie2蛋白表达量均较假手术组增高，说明脑缺血后存在一定程度血管新生；通窍益智颗粒中、高剂量组海马区微血管密度及海马组织中Ang-1、Ang-2、Tie2蛋白表达量均明显高于模型组，说明通窍益智颗粒可影响Angiopoietin /Tie2信号通路，明显促进血管新生，从而改善神经血管单元功能。

血管性痴呆属于中医学“痴呆”“善忘”范畴，认为其病位在脑，是本虚标实之证。历代医家多从补肾填精、化痰通络、活血化瘀、醒脑开窍等角度组方用药[26]，取得了一定疗效，但对于痴呆的中医微观病机和治法研究甚少。本课题组继承全国名老中医王明杰教授学术思想，提出微观脑玄府是气血升降出入的场所，“神识”的产生依赖于气血正常交互。脑为髓海，元神之府，神机的正常交互得益于气机通利；而在神经血管单元中，血脑屏障和微循环结构和功能的完整可保证神经元对氧、糖的摄取利用。同时，玄府自身功能同样需要气血渗溉，而血脑屏障通过胞吞转运等过程维持其选择性通透需要正常的能量代谢。玄府郁闭，气血津液运行阻滞，一则神机失去物质基础无以化生，二则神机交互失所，故表现为呆症；而慢性脑低灌注引起的脑血流量降低、血脑屏障损伤，导致脑代谢降低是血管性痴呆的典型病理生理表现。因此课题组认为脑玄府郁闭是血管性痴呆的基础和核心环节。

“巅顶之上，唯风药可及”，风药上行下达，彻内彻外，是开通玄府效果最为明显的一类药物。课题组针对血管性痴呆重用风药，辅以虫类药，契合“风邪留于经络，须以虫蚁搜剔”的原则，组方通窍益智、补虚达神，开通郁闭之脑，以开通玄府为先，既不违背中医整体观和辨证论治的大纲，同时针对痴呆的微观病机即玄府郁闭进行干预，前期研究证实可改善血管性痴呆大鼠学习、记忆能力，抑制海马神经元细胞凋亡[27-28]。通过临床用药和前期研究的优化调整，本研究所用通窍益智颗粒组方中重用葛根为君，取其轻灵透达、升发宣通之性，开通玄府；虫药地龙、水蛭及川芎为臣，共助气血调畅、玄府开通；以黄芪、人参、灵芝为佐，使气血充沛，支撑玄府运转通达；使以石菖蒲，达芳香化痰、引诸药入脑之功效。现代药理学研究表明，上述诸药可能具有改善慢性脑缺血、保护血脑屏障、抑制脑细胞凋亡、减轻炎症和再灌注脑组织损伤的作用[29-33]。本实验研究结果显示，通窍益智颗粒改善血管性痴呆大鼠认知障碍可能与修复血脑屏障结构和功能障碍，促进血管新生，增加脑灌注，从而改善神经血管单元功能有关，但针对神经血管单元以及血脑屏障具体各组分作用机制及作用靶点仍有待进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。