麻黄-葛根药对治疗糖尿病周围神经病变的药理作用

梅景雁 沈创鹏 孙治中 曾丽盈 万晓刚

摘要 目的：利用中药整合药理学平台及分子对接研究探讨麻黄-葛根药治疗糖尿病周围神经病变的分子机制。方法：首先在疾病靶点筛选数据库和中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索获取与糖尿病周围神经病变（DPN）相关的靶标基因及麻黄、葛根的活性成分;然后使用Excel查重获得药物与疾病的共同靶点，使用Cytoscape绘制蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图，对共同靶点进行基因本体（GO）富集分析，通过DAVID网站进行京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析;最后用Cytoscape软件构建“药物-活性成分-关键靶点基因”关系网络，并用Systems Dock网站进行分子对接，评估活性成分及靶点结合的稳定性。结果：麻黄-葛根药对作用于DPN的活性成分有21个，共同靶点基因138个。该药对治疗DPN富集结果主要集中于去除超氧自由基等7个功能组别中，主要富集的通路包括蛋白激酶C通路、多元醇通路等，治疗作用的靶标主要是PKC、PTGS2、Nrf2等。结论：麻黄-葛根药可能是通过对抗氧化应激及炎症反应、减缓神经髓鞘及施万细胞的损害、改善微循环等途径来治疗DPN的。

关键词 网络药理学;分子对接;信号通路;关键靶点;麻黄;葛根;糖尿病周围神经病变

Abstract Objective：To explore the molecular mechanism of Herba Ephedrae and Radix Puerariae drug pair in the treatment of diabetic peripheral neuropathy by using the integrated pharmacology platform of traditional Chinese medicine and molecular docking research.Methods：Firstly searched the disease target screening database and TCMSP platform to obtain the related target genes of DPN，Herba Ephedrae and Radix Puerariae and the active ingredients of the latter; then use excel to checked the common targets of drugs and diseases，and used Cytoscape to draw PPI Network diagram，GO enrichment analysis of common targets，and KEGG pathway analysis through DAVID website; finally used Cytoscape software to construct a “drug-active ingredient-key target-Gene” relationship network，and use the Systems Dock website for molecular docking to evaluate the stability of active ingredients and target binding.Results：Herba Ephedrae and Radix Puerariae drug pair had 21 active ingredients that act on diabetic peripheral neuropathy，and 138 common target genes.The results of the drug′s treatment of DPN enrichment mainly focused on removal of Among the seven functional groups such as removal of superoxide radicals，the main enriched pathways included PKC signaling pathway，Polyol pathway activation，etc.The main therapeutic target is PKC，PTGS2，Nrf2，etc.Conclusion：Herba Ephedrae and Radix Puerariae may be treated by anti-oxidative stress and inflammatory response，slowing down the damage of nerve myelin and Schwann cells，and improving microcirculation.

Keywords Network pharmacology; Molecular docking; Signal pathway; Key target; Herba Ephedrae; Radix Puerariae; Diabetic peripheral neuropathy

中圖分类号：R282;R587.2文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.01.009

麻黄，性温，味辛、微苦，入肺、膀胱经[1]，《神农本草经》里记载其“主上气咳逆，结气，喉痹吐吸，利关节”;葛根，性平，味甘、辛，入脾、胃经[1]。古代医方有二者共用者，如《伤寒论》中治疗太阳经脉不利之桂枝加葛根汤、葛根汤，又如《圣济总录》中治疗伤寒温病吐下、余热未尽之麻黄葛根汤，皆取麻黄-葛根配伍后发散解表、通络生津之效。

糖尿病周围神经病变（Diabetic Peripheral Neuropathy，DPN）是糖尿病神经病变最常见的类型，其发病与糖类物质沉积于周围微小血管壁，引发神经组织供血匮乏等有关，临床表现为四肢末端感觉障碍、麻木、刺痛等[2-3]。相关研究提示麻黄有保护胰岛以及改善糖耐量异常的作用[4]，葛根素可改善DPN患者血液流变学及肌电图[5]。临床上取麻黄开腠发汗、葛根解肌舒经之效，将此药对用于DPN表现为四肢麻木、痹痛的患者，多有效果。

目前西医治疗DPN的途径主要集中在控制血糖、改善微循环、改善代谢紊乱、营养神经等[6]。但由于中药成分的复杂多样性，针对中药作用于DPN的分子机制的相关论述研究仍然较少。本研究运用网络药理学方法[7]，从靶点及通路探索麻黄-葛根药对与DPN的现代药理学联系，以期为进一步研究提供基础理论支持。

1 资料与方法

1.1 麻黄与葛根化学成分和成分靶点信息获取及收集

使用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（version 2.3），设定药物成分口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18和药物半衰期（Half Life，HL）≥4分析筛选出麻黄、葛根中具有良好的OB、DL和药物HL的化合物及其靶点。将TCMSP筛选出的成分靶点全称输入DrugBank获取基因简称。

1.2 麻黄-葛根药治疗DPN潜在靶点的获取及收集

以关键词“Diabetic peripheral neuropathy”在DisGeNET、GeneCards和Drugbank这3个疾病靶点筛选数据库检索获取与DPN相关的靶标基因，合并数据去重，将最后筛选出的靶点基因全称输入DrugBank、UniProt获取基因简称。将获取的药物成分靶点及疾病靶点导入Excel查重，这些重复的靶点即为麻黄-葛根作用于DPN的可能靶点。再将上述靶点与对应的活性成分导入Cytoscape 3.6.0进行匹配映射，并绘制成分靶点图。

1.3 潜在靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络图的构建

利用string数据库，检索以上潜在治疗靶点之间的关系，导入Cytoscape 3.6.0软件，生成蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）网络图。

1.4 功能富集分析与通路富集分析

使用Cytoscape中GlueGO功能对获取的靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析，通过DAVID网站进行京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，设定P<0.01，选择gene值在前20的通路，利用OmicShare网站将结果以气泡图的形式呈现。

1.5 药物活性成分-靶点-通路网络图的构建

将以上获得的通路，结合麻黄-葛根的活性成分及DPN治疗靶标，使用Cytoscape软件（Version3.6.0）构建“药物-活性成分-关键靶点基因”关系网络，该网络展示了药物活性成分-DPN靶标-KEGG通路之间的联系。

1.6 分子对接

运用Systems Dock网站对Degree值排名前5名的预测靶标与药物活性成分进行分子对接，通过比较Docking Score值来评估活性成分及靶点结合的稳定性。若Docking Score值在4.25分以上，则认为分子与靶点有一定的结合活性，大于5.0说明有较好的结合活性，大小7.0说明具有强烈的结合活性。

2 结果

2.1 DPN疾病靶点的收集

基于DisGeNET，GeneCards，Drugbank数据库共收集DPN相关靶点基因共2 722个，删除重复靶点后得到DPN疾病作用靶点2 680个，得到的靶点信息进行基因名的标准化。

2.2 麻黄-葛根活性成分的筛选

通过TCMSP数据库以OB≥30%、DL≥0.18和HL≥4为条件检索的麻黄潜在活性成分17个，葛根潜在活性成分4个。见表1。

2.3 麻黄-葛根药治疗DPN潜在靶点

将麻黄、葛根2味药物与DPN重复的138个靶点基因及其对应的21个活性成分导入Cytoscape软件进行网络构建及可视化。见图1。

2.4 靶点PPI网络图

将上述138个靶点，导入string数据库分析靶点之间的相互作用，利用Cytoscape 3.6.0软件生成PPI网络图。利用Cytoscape 3软件中network analysis功能分析靶点的degree值，以degree二倍中位值作为筛选条件，选取核心靶点共47个，构建出核心靶点网络图，图中节点颜色越深、大小越大表示该靶点的degree值越高、与其他靶点相关性越大。其中连接度前5的关键靶点基因为PKC（蛋白激酶C）、PTGS2（前列腺素G/H合成酶2）、Nrf2、IGF-1（胰岛素样生长因子1）、glu-LDL（糖基化低密度脂蛋白）。见图2。

2.5 GO富集分析

应用Cytoscape中GlueGO功能，进行GO富集中的生物过程分析，得到7个功能组别，主要集中在Regulation of mononuclear cell migration（調节单核细胞迁移）、Removal of superoxide radicals（去除超氧自由基）、Negative regulation of epithelial cell apoptotic process（上皮细胞凋亡过程的负调控）、Synaptic transmission dopaminergic（突触传递多巴胺能）、Negative regulation of muscle contraction（肌肉收缩的负调节）、Positive regulation of macrophage differentiation（巨噬细胞分化的正调节）、Activation of cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic signaling pathway（凋亡信号通路中半胱氨酸型内肽酶活性的活化）上。见图3～4。

2.6 KEGG通路富集分析

通过KEGG通路富集分析，根据P值筛选出与糖尿病相关的富集通路共20条，其中PKC signaling pathway（蛋白激酶C通路）占比最大，其余主要富集的通路还有Polyol pathway activation（多元醇通路）、AGEs signaling pathway（晚期糖基化终末产物通路）、RAGE signaling pathway（晚期糖基化终末产物受体通路）、Phosphatidylinositol signal pathway（肌醇代谢通路）等。见图5。

2.7 药物活性成分-靶点-通路网络图的构建

结合以上得到的靶点及通路分析结果，使用Cytoscape软件（Version 3.6.0）构建关系网络，展示药物活性成分-DPN靶标-KEGG通路之间的联系，通过构建这一网络探析麻黄-葛根治疗DPN的作用机制。麻黄-葛根治疗DPN与槲皮素（quercetin），β-谷甾醇（beta-sitosterol）等活性成分有关，与PKC、PTGS2等靶点有关，与Polyol pathway activation、AGEs signaling pathway等通路有关，通路主要集中作用在氧化应激、炎症反应、周围神经损害、微循环障碍4个方面。见图6。

2.8 分子对接

运用Systems Dock网站，选取Degree值排名前5的预测靶标与麻黄-葛根活性成分进行分子对接，分析Docking Score值，再使用GraphPiad Prisn 7.0软件制作出热图。大部分Docking Score值可高于4.25，所选取麻黄-葛根的活性成分与预测靶标有一定结合能力。见图7。

3 讨论

3.1 靶点分析

根据以上分析结果，本研究得到麻黄-葛根药对中可能作用于DPN的活性成分主要包括槲皮素（quercetin），β-谷甾醇（beta-sitosterol），芒柄花黄素（formononetin），山柰酚（kaempferol）等。而可能发挥治疗作用的靶标主要是蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC）、前列腺素G/H合成酶2（Prostaglandin G/H Synthase 2，PTGS2）、Nrf2、胰岛素样生长因子-1（Insulin-like Grown Factor-1，IGF-1）、糖基化低密度脂蛋白（glu-LDL）等。PKC是一种分布在细胞质的酶，在第二信使的作用下能被激活参与包括糖代谢在内的生化反应。例如体内过多的三酰甘油就可激活PKCθ，抑制胰岛素受体底物酪氨酸的磷酸化，从而导致2型糖尿病的胰岛素抵抗[8]。有研究表明，PKC-β选择性抑制剂可以改善链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠周围神经的血流量及传导速度[9]。另一关键靶点基因PTGS2也称COX-2，是一种诱导性酶，它与众多炎症介质表达相互作用，是细胞炎症反应过程的关键环节之一[10-11]。有研究用药物抑制COX-2活性，阻断脊髓背角pERK的活化和IL-1β/COX-2/PGE2通路，能减轻神经根炎性疼痛[12]、减少高炎症水平导致的胰岛B细胞的功能损伤、减少胰岛B细胞的凋亡[13]。Nrf2因子是抗氧化反应的主要调节剂，它在高糖环境下的调节紊乱会导致氧化应激失衡及高血糖损害[14]，有研究证实，糖尿病大鼠的坐骨神经中Nrf2的表达较正常大鼠下调[15]。IGF-1是一种与胰岛素分子结构相似的多肽蛋白质，Chu等[16]的实验证明提高IGF-1的循环水平可以改善STZ治疗糖尿病小鼠的高痛觉过敏和神经元功能，若通过基因疗法进一步提高血清IGF-1水平，还能改善其运动功能。另外IGF-1还能通过胰岛素受体磷酸化来磷酸化PI3-K，从而激活AKT通路，促进周围神经系统中的神经胶质细胞——施万细胞成活，阻止其凋亡[17]。DPN与血脂代谢异常相关[18]，糖基化低密度脂蛋白是低密度脂蛋白（LDL）糖基化后形成的产物，它可被糖基化末端产物受体内化，释放三酰甘油及游离脂肪酸，启动炎症信号途径，同时消耗NADPH产生超氧自由基启动氧化应激反应[19]。其他的相关靶点，如COX-2、TNF-α、DRP1等，则涉及炎症反应、神经元细胞凋亡、血管内皮损伤等多个病理过程。

3.2 通路分析

KEGG通路富集分析显示，麻黄-葛根治疗DPN的关键靶点基因富集程度靠前的通路包括PKC signaling pathway（蛋白激酶C通路）、Polyol pathway activation（多元醇通路）、AGEs signaling pathway（晚期糖基化终末产物通路）、RAGE signaling pathway（晚期糖基化终末产物受体通路）、Phosphatidylinositol signal pathway（肌醇代谢通路）等。查閱相关文献资料后可发现，排名前5的通路对DPN作用主要集中在神经本身的损害及氧化应激2个方面。当体内处于高糖环境时，Polyol代谢通路被施万细胞中的醛糖还原酶激活，生成山梨醇，山梨醇在施万细胞内大量堆积，使得细胞内呈高渗状态，从而加快了神经细胞的水肿、变性及坏死，进一步则引起神经髓鞘脱失及神经纤维再生延迟[20]。同时，Polyol通路生成的三酰甘油还能激活PCK通路，PCK通路则通过影响核因子κB、血管内皮生长因子等，导致组织缺氧、微循环障碍，最终降低DPN患者的血流速度和神经传导速度并引起疼痛[21]。RAGE即AGEs受体，AGEs与RAGE结合后，可破坏神经髓鞘的完整性，影响神经组织的微管蛋白，导致轴突萎缩、变性，使神经的再生和修复受阻[22-23]。肌醇与葡萄糖的结构极其相似，在高血糖状态下葡萄糖可竞争性抑制神经组织摄取肌醇，使得Na+-K+-ATP酶活性的下降，引起异常信号转导及血管改变，最终导致神经纤维的结构被破坏。

另一方面，由于Polyol通路中醛糖还原酶过度的活跃及果糖过量的生成，还原型辅酶Ⅱ被大量消耗，ROS清除不足，可诱发胞内氧化应激反应[24]。有研究发现，在缺血再灌注的DPN大鼠中应用醛糖还原酶抑制剂后，大鼠的神经传导速度和神经症状都能得到一定程度的改善[25]。AGEs/RAGE信号通路的激活同样可以释放活性氧（ROS）诱发氧化应激，还可通过激活Nox-1和核因子κB、降低SOD-1的表达来增加氧化应激，从而促进糖尿病介导的血管钙化及神经营养不足[26]。除上述通路外，关键靶点还富集于核因子κB、PPAR、Hexosamine、PI3K等众多通路上，表明麻黄-葛根治療DPN是各通路协调作用的结果。

综上所述，麻黄-葛根药对治疗糖尿病周围神经病变可能是通过对抗氧化应激及炎症反应、减缓神经髓鞘及施万细胞的损害、改善微循环等途径来取得治疗效果的，这是一个中药活性成分作用于疾病的多靶点、多通路的过程。

参考文献

[1]钟赣生.中药学[M].北京：中国中医药出版社，2012：36，39.

[2]杨青青，李全民.糖尿病周围神经病变筛查与诊断进展[J].中国医药，2013，8（6）：876-878.

[3]Lupachyk S，Watcho P，Stavniichuk R，et al.Endoplasmic reticulum stress plays a key role in the pathogenesis of diabetic peripheral neuropathy[J].Diabetes，2013，62（3）：944-952.

[4]吴浩.麻黄附子细辛汤联合参麦注射液治疗缓慢型心律失常患者的临床疗效[J].中国药物经济学，2017，12（1）：55-57.

[5]王凌霄，温宏峰，才丽娜，等.葛根素注射液治疗糖尿病周围神经病变的疗效及对肌电图、血液流变学的影响[J].世界中医药，2018，13（8）：1929-1932.

[6]陈国铭，钟晓莹，赵金龙，等.黄芪桂枝五物汤治疗糖尿病周围神经病变靶点预测与机制探讨[J].中国实验方剂学杂志，2018，24（8）：214-222.

[7]世界中医药学会联合会.网络药理学评价方法指南[J].世界中医药，2021，16（4）：527-532.

[8]Szendroedi J，Yoshimura T，Phielix E，et al.Role of diacylglycerol activation of PKCθ in lipid-induced muscle insulin resistance in humans[J].Proc Natl Acad Sci USA，2014，111（26）：9597-9602.

[9]Vareniuk I，Pavlov IA，Obrosova IG.Inducible nitric oxide synthase gene deficiency counteracts multiple manifestations of peripheral neuropathy in a streptozotocin-induced mouse model of diabetes[J].Diabetologia，2008，51（11）：2126-2133.

[10]Cox DG，Crusius JB，Peeters PH，et al.Haplotype of prostaglandin synthase 2/cyclooxygenase 2 is involved in the susceptibility to inflammatory bowel disease[J].World J Gastroenterol，2005，11（38）：6003-6008.

[11]Fasano MB，Wells JD，McCall CE.Human neutrophils express the prostaglandin G/H synthase 2 gene when stimulated with bacterial lipopolysaccharide[J].Clin Immunol Immunopathol，1998，87（3）：304-308.

[12]吴海璇，冯璐璐，贺秋兰，等.蛇床子素对髓核致坐骨神经痛大鼠DRG中CGRPR1表达的影响[J].中国药理学通报，2014，30（1）：49-54.

[13]Wang G，Liang R，Liu T，et al.Opposing effects of IL-1β/COX-2/PGE2 pathway loop on islets in type 2 diabetes mellitus[J].Endocr J，2019，66（8）：691-699.

[14]Jiménez-Osorio AS，González-Reyes S，Pedraza-Chaverri J.Natural Nrf2 activators in diabetes[J].Clin Chim Acta，2015，448：182-192.

[15]Xu Z，Wei Y，Gong J，et al.NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice[J].Diabetologia，2014，57（1）：204-213.

[16]Chu Q，Moreland R，Yew NS，et al.Systemic Insulin-like growth factor-1 reverses hypoalgesia and improves mobility in a mouse model of diabetic peripheral neuropathy[J].Mol Ther，2008，16（8）：1400-1408.

[17]Ammoun S，Schmid MC，Zhou L，et al.Insulin-like growth factor-binding protein-1（IGFBP-1） regulates human schwannoma proliferation，adhesion and survival[J].Oncogene，2012，31（13）：1710-1722.

[18]Mohapatra D，Damodar KS.Glycaemia Status，Lipid Profile and Renal Parameters in Progressive Diabetic Neuropathy[J].J Clin Diagn Res，2016，10（9）：CC14-CC17.

[19]Zochodne DW.Mechanisms of diabetic neuron damage：Molecular pathways[J].Handb Clin Neurol，2014，126：379-399.

[20]Li G，Sun C，Wang Y，et al.A clinical and neuropathological study of Chinese patients with diabetic peripheral neuropathy[J].PLoS One，2014，9（3）：e91772.

[21]Das Evcimen N，King GL.The role of protein kinase C activation and the vascular complications of diabetes[J].Pharmacol Res，2007，55（6）：498-510.

[22]Khangholi S，Majid FA，Berwary NJ，et al.The Mechanisms of Inhibition of Advanced Glycation End Products Formation through Polyphenols in Hyperglycemic Condition[J].Planta Med，2016，82（1-2）：32-45.

[23]Park SY，Kim YA，Hong YH，et al.Up-regulation of the receptor for advanced glycation end products in the skin biopsy specimens of patients with severe diabetic neuropathy[J].J Clin Neurol，2014，10（4）：334-341.

[24]Croze ML，Soulage CO.Potential role and therapeutic interests of myo-inositol in metabolic diseases[J].Biochimie，2013，95（10）：1811-1827.

[25]Wang Y，Schmelzer JD，Schmeichel A，et al.Ischemia-reperfusion injury of peripheral nerve in experimental diabetic neuropathy[J].J Neurol Sci，2004，227（1）：101-107.

[26]Kay AM，Simpson CL，Stewart JA Jr.The Role of AGE/RAGE Signaling in Diabetes-Mediated Vascular Calcification[J].J Diabetes Res，2016，2016：6809703.

（2020-10-20收稿 本文編辑：杨觉雄）